RNA干扰技术及其应用.ppt

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1、RNA干扰技术及其应用生工1002李奔存TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006安德鲁·法尔AndrewZ.Fire美国美国麻省理工学院1959～雷格·梅洛CraigC.Mello美国哈佛大学1960～FortherediscoveryofRNAinterference-genesilencingbydouble-strandedRNARNAi（RNAinterference，RNA干扰）Double-strandedRNAinhibitsexpressionofgenes

2、homologoustothatRNA.双链RNA抑制含其同源序列基因的表达BriefHistoryofRNAiDiscoveries1990年，RichJorgensen设想，在矮牵牛中花插入一种催生红色素的基因，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，花的颜色变为白色，当时称共抑制（cosuppression)95年Guo和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，

3、反而产生与反义RNA同样的结果——特异性阻断该基因的表达，从而正式表明RNA干扰现象的存在。94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制(quelling)。1998年AndrewFire等首次将正义链反义链RNA混合注入线C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNAinterference的概念Acontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNA2001年Elbashir等《Nature》上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功的

4、在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。三.RNAi作用机制起始阶段效应阶段扩增扩散阶段起始阶段病毒基因、人工转入基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA这些dsRNA被胞质中的RNaseⅢ特异核酸酶Dicer切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNAsiRNA的特点：3’端均有2～3个突出的核苷酸siRNA双链结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,orRISC）效应阶段

5、在ATP存在情况下，siRNA双链展开激活RISC，激活的RISC即可通过碱基互补与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA。依次循环：新合成的长链ds

6、RNA同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成一切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。扩增扩散阶段四、RNAi研究的一般技术路线确定目的基因设计siRNA的序列获得siRNA产物siRNA转染RNAi效果检测化学合成体外转录长片段RNA消化siRNA表达载体siRNA表达框架1.siRNA的一般结构：哺乳动物：21-23bpdsRNA其它生物：更长的片段dTdT（UU）（UU）dTdT四siRNA的设计2.设计流程（选择siRNA靶位点）从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下

7、游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点；根据5‘和3’非翻译区（UTR)及靠近起始密码子（75个碱基之内）等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它编码序列同源的靶序列。设计阴性对照：阴性对照siRNA应与siRNA的核苷酸组成相同但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸顺序并经同源序列比较确证而得。获得siRNA产物1、化学合成尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。许

8、多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究；不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要