rna干扰irna技术及其应用

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1、RNA干扰iRNA技术及其应用摘要：RNA干扰(interferenceRNA,iRNA)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA吋，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。RNA具有特异性和有效性。iRNA技术作为功能基因组学强有力的研究工具，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变。随着对现代分子生物学研究的发展，该技术的应用领域逐步扩展到医学，农业，林业，渔业，畜牧等多个领域，具有巨大的科研，经济和社会价值，本文主要论述RNA干扰技术在医学

2、领域方面的应用。关键字：RNA干扰转录后基因沉默RNA诱导的沉默复合物正文：今年来，对RNA干扰技术的研究已经成为热点，预测未来10年间最后可能出重要成果的领域之一，并被《Science》评选为2002年度最重要科技突破的首位。RNA干扰技术之所以有如此重要的地位，与其运用到的领域有关。21世纪初，人类完成了基因组计划，破译人类全部的遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自我。因此，很多疾病的病因也将揭开祌秘的面纱，这位这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。因此，利用RNA干扰技术抑制基因组的基因表达的技术手段，有可能在基因治疗方面开辟一条心的途径，克服医

3、学上许多疑难杂症，例如，病毒性疾病，肿瘤心血管疾病和遗传性疾病。1.RNA干扰的发现：首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditiselegans的研究。1995年，康乃尔大学的SuGuo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研宂小组一直未能给这个意外以合

4、理解释。这个奇怪的现象直到3年后j被解开。1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMe11o才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，SuGuo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够完全阻断同源基因的表达。后

5、来的实验表明在线虫中注入双链RNA不-单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默，该小组将这一现象称为KNA干扰。现在RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞，这种情况揭示了iRNA现象很可能出现于生命进化的早期阶段。后来在果蝇细胞中的实验进一步揭示这个秘密。在一系列著名的实验中，Zamore和同事发现注入果蝇细胞的dsRNA被切割为21〜23碱基长短的RNA片段，他们同时发现：与dsRNA同源的内源基因的mRNA,只在和dsRNA对应的部位被切割成为21—23核苷

6、酸长的片断。很快，iRNA的机制越来越清楚了。1.iRNA干扰作用机制：iRNA的作用体现在两种水平上。①转录水平。RNA可以介导DKA的甲基化最早发现于一种植物的类病毒系统。dsRNA被降解成21〜23个核苷酸长的小片段RNA时，这些小的RNA分子在细胞核可以诱发同源序列的DNA甲基化。这种序列特异性的甲基化的信号与RNA-DNA结合有关。当dsRNA含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默。②转录后水平。（1）特异切割dsRNA的RNA酶III家族核酸酶Dicer依赖ATP切割dsRNA,将其分解成具有2

7、个核苷酸的3’端的19〜21b小片段的双链siRNA。（2）RTSC（RNA诱导的沉默复合物）识别并降解mRNA。RISC是一种蛋白-RNA效应器核酸酶复合物。双链siRNA为RISC的重要组分，它依赖ATP解旋导致RTSC活化，然后通过Waston-Crick碱基配对识别底物mRNA并与之结合，并自siRNA的3’端将mRNA切割成小于12nt的片段使其降解。对一些人组织因子的试验表明，几个不同的siRNA可以攻击同一个mRNA的不同位点。只有一部分siRNA会导致显著的基因沉默，这说明在人mRNA上的siRNA结合位点可能很少，且不活跃的siRNA与活跃的s

8、iRNA可逆性竞争。并且