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1、RNA干扰的原理及其应用一、RNAi的发现简史90年代初，RichJorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将这种现象命名为共抑制现象(cosuppression),因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素
2、基因导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称为“quelling”现象。What’smore...1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA(antisenseRNA)去阻断秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis.elegans)的par-1基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA的确能够阻断基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA(senseRNA)作为对照,也同样阻断了基因的表达。这与传统
3、上对反义RNA技术的解释正好相反。反义RNA技术反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早是在E.coli的产肠杆菌素的ColE1质粒中发现的，许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。反义RNA技术根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列(Shine-Dalgarnosequen
4、ce）和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ降解Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。反义RNA技术的原理利用基因重组构建人工表达载体,使其体外或体内表达反义RNA,通过碱基互补与靶RNA配对结合,封闭或抑制靶基因的表达,从而对细胞的功能产生影响这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次将双链dsRNA———正义链
5、和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链ＲＮＡ已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA
6、的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。RNA干扰 （RNAinterference，RNAi）RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。二、RNAi现象的普遍性随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi能高效特异的阻断基因的表
7、达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。三、RNAi的作用机制基因沉默基因沉默分为转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)两种：TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默；对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致;PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。目前普遍认为RNA
8、i、共抑制、quelling均属于PTGS！dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。r
