rna干扰技术及应用

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1、RNA干扰技术及应用目录RNA干扰的发现RNA干扰的作用机制RNAi研究的一般技术路线RNA干扰技术的应用展望及问题TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006安德鲁·法尔AndrewZ.Fire美国美国麻省理工学院1959～雷格·梅洛CraigC.Mello美国哈佛大学1960～FortherediscoveryofRNAinterference-genesilencingbydouble-strandedRNA一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRN

2、A降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）RNAi-----RNAinterferencesiRNAs-----SmallinterferingRNAs(小干扰性RNA)dsRNA------doublestrandRNA(双链RNA)RISC------

3、RNA-inducedsilencingcomplex(RNA诱导沉默复合物)Dicer------RNAaseIII—relatedenzymes(RNAaseIII家族成员)PTGS------Post-transcriptionalgenesilencing转录后基因沉默Glossary(术语)(RNA干扰)RdRP-------RNA-directedRNApolymerase(RNA指导RNA聚合酶)一、RNA干扰的发现历史1990年，为加深矮牵牛花(petunias）的紫色，Jorgensen等导入了一个强

4、启动子控制的色素基。可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和内源基因的表达都被抑制了．Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)1994年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制(quelling)。1995年，靡奈尔大学的SuGuo在用反义RNA(antisenseRNA)阻断线虫基因表达的试验中发现．反义RNA(antisenseRNA)和正义RNA(senseRNA)都阻断了基因的表达，当时他们对这个结果感到十分困惑。1998年，华盛顿

5、卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现SuGuo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级（如图1）他们首次提出了RNAinterference

6、的概念靡奈尔大学的SuGuo阻断线虫基因表达的试验1999年短短的一年间,发现RNA干涉现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RＮＡ干涉现象。2001年Elbashir等《Nature》上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景，2002年美国《科学》杂志将其评为全球年度十大科学进

7、展之首。二、RNAi作用机制起始阶段效应阶段扩增扩散阶段起始阶段病毒基因、人工转入基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA这些dsRNA被胞质中的Dicer酶切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNA。（dicer是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因病毒感染等各种方式引入的双链RNA）siRNA的特点：3’端均有2～3个突出的核苷酸siRNA的结构siRNA通常是一

8、段长21个核苷酸的双股RNA（dsRNA），其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸，图示如下：每一股各有一个5'磷酸基末端与一个3'羟基末端。此结构经dicer作用而得。此外，siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲除（knockdown）效果。本质上，任何已