家蚕核型多角体病毒BmNPVBm61、orf74的基因分析

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1、江苏大学博士学位论文家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm61、orf74的基因分析姓名：申红星申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：陈克平20090606江苏大学博士学位论文：家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bin61、orf74配q基因分析PCR显示转染细胞的上清中没有BV产生，和m61的拯救病毒表现出和野生病毒相同的特性。证明Bm61是BV产生的必需基因。进一步分析Bin61缺失不影响病毒基因组复制和gp64的转录。4．off74位于BmNPV基因组的69，987．70，449nt之间，全长462bp，编码154个氨基酸残基，预测分子量大约为17．3k

2、Da。在orf74基因ATG上游9nt处有一个杆状病毒晚期转录基序TTAAG。orf74是AcMNPVorff)l的同源序列，5．or]74的转录分析表明，off74从病毒感染后12h开始转录，一直持续蛰J96h，可能是一个晚期表达基因。利用ORF74与GFP融合对其亚细胞定位进行了观察，发现ORF74的表达集中在细胞核。6．敲除orf74基因后构建了缺失orf74的病毒vBm．ko。vBm．ko在BmN上的复制结果表明：orf74的敲除不影响病毒在BmN细胞上增殖和基因组复制。幼虫分析表明D玎殍的敲除可以延长病毒杀死幼虫的时问，但是病毒的产量没有明显差异。这

3、些结果表明orf74可能足病毒复制的非必须基因，可能与病毒的毒力有关。关键词：家蚕核型多角体病毒，Bm61，off74，基因分析，基因敲除ⅡABSTRACTThefamilyBaculoviridaeisahighiyselectivepathogeninarhropods，mainlyininsectsoftheorderLepidoptera．Sofar，thegenomesof47baculoviruseshavebeensequeneced．Anditisrevealedthat30genesarebaculoviruscoregenesand62ge

4、nesareconservedinLepidopterabaculovirusesafteranalyzingthewholegenomes．Bombyxmorinueleopolyhedrovirusisoneofmoststudiedbaeuloviruses；somegeneshavenotbeencharacterized．Inthisstudy，anon—conservedgenes(orf74)andaconservedgenes(Bm61)inLepidopterabaculovirusesarecharacterized．Thesetwogen

5、eswerecharacterizedfromthetranscription，expression，cellularlocationandknockout．Theobjectofthisstudyistoenhanceourunderstandingofbaculovirusmolecularbiology．Theresultsareasfollowing：1．orf61(Bm61)islocatedatnt61，188—-61，892ofBmNPVgenome，containing399bpandcoding133aawithapredictedmolec

6、ularweightof15．5kDa．Bm61isthehomologysequenceofAcMNPV的orf75．Thelatetranscriptionmotifofbaculoviridae，ATAAGwaslocatedattheupstreamofATG．Andthetranscriptionterminalsignal，AATAAwasfoundatthedownstreamoftheterminalcodon删。2．TheRT—PCRresultsshowedthatBm61geneswastranscribedintheinfectedce

7、llsfrom12hto72h．Bm61fusionproteinwasexpressedusingtheE．coliexpressionsystemandpolyclonalantibodieswereharvested．ThewesternblotanalysisshowedthatBm61wasdetectedintheinfectedcellsfrom12to72h，whichfurthersuggestingthatBin61isalategene．ThedetectedBm61hadamolecularweightof15．5kDa，sameast

8、hepredictedone，whic