利用Red重组系统敲除家蚕核型多角体病毒的vlf-1基因及对病毒复制的影响.pdf

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1、5cneeD2013，39(2)：0283—0288ISSN0257—4799；CN32—1115／SE—mail：CYKE@chinajourna1．net．cn利用Red重组系统敲除家蚕核型多角体病毒的vlf-1基因及对病毒复制的影响杜超逸于威全滟平，陈健，2聂作明，吕正兵，2张耀洲，(浙江理工大学生物化学研究所，杭州310018；浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，杭州310018)摘要利用Red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在EcoliDH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因l，调查对病毒复制的影响，以探

2、究BmNPVl基因的功能。首先从E．coliBW25113中提取能表达Red重组酶的质粒pKD46，将其转化到E．coliDH10Bac中，获得可用于BmNPV基因打靶的DH10Bac(含有质粒pKD46)菌株；再为发生基因同源重组设计一对长6qbp的引物，5端长40bp，分别为1基因的左右同源臂，3端长20bp，分别为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列；以含有cat的pKD3质粒为模板，PCR扩增含1同源臂的cat基因，即打靶线性化片段；将该线性化片段转入DH10Bac(pKD46)菌株，在Red重组酶的作用下，线性化片段与BacmidDNA中的1基因

3、发生同源重组。利用设计的2对特异性gl物PCR验证cat基因替换口1基因操作成功，获得口1缺失型BmNPV。将vtf-1缺失型BacmidDNA转染BmN细胞，利用qPCR分析够1基因缺失对于病毒复制的影响，结果表明：1基因缺失对BmNPV起始DNA复制没有明显的影响，但是可能影响之后的病毒装配和侵染。关键词家蚕核型多角体病毒；1基因；Red重组系统；病毒复制中图分类号$884．5l；Q78文献标识码A文章编号0257—4799(2013)02—0283—06Knockoutofvlf-1GeneinBombyxmoriNucIe0p0lyhedrOVi

4、rusUsingRedRecombinationSystemandItsInfluenceonViralRepli—cationDUChao—YiYUWeiQUANYan—PingCHENJianNIEZuo—MingL0Zheng—BingZHANGYao—Zhou’，(instituteofBiochemistry，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou310018，China；ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofSilkwormBioreactorandBiomedicine，Hangz

5、hou310018，China)AbstractInordertoexplorethefunctionofBmNPV(Bombyxmorinucleop0fyhedrovirus)vlf-1geneinviralreplication，RedrecombinantsystemandBmNPVBacmidwereutilizedtohaveaquickknockoutofBmNPVvlf-1geneinEcoilDH10Bac．Firstly．pKD46plasmidcapableofexpressingRedrecombinasewasisolatedf

6、rOmEcoilBW25113andtrans—formedintoEcoilDH10BactoobtainEcoilDH10Bac(containingpKD46)，whichcouldbeusedfortargetingBmNPVgene．Then，forhomologousrecombinationofthetargetgene，apairofprimerswith60bpinlengthwasdesigned，收稿日期：2012—10—06接受日期：2012—11—16资助项目：国家高技术研究发展计划“863”项目(No．201lAA1006—w

7、ith40bpattheir5endhomologoustotheleftandright03)，浙江省自然科学基金项目(No．Y3090339，Y31101armofvlf-1generespectively．and20bpattheir3end87)，浙江省教育厅科技项目(No．Y201019102)。homologoustothebeginningandendingsequenceofcat第一作者信息：杜超逸(1988一)，男，硕士研究生。generespectively．AlinearfragmentwasamplifiedbyE-mail：c

8、haoyidu@126．corn通信作者信息：于威，副教授，硕士生导师。PCRf