家蚕核型多角体病毒几丁质基因克隆表达及表达产物对bt杀虫剂增效作用

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1、浙江夫学硕I一学位论文摘要杆状病毒是鳞翅目昆虫重要的病原微生物，在农业害虫防治中具有很大的应用前景。同时杆状病毒一昆虫(虫体)表达系统是最近发展起来的高效表达外源基因的真核表达系统。因此杆状病毒近年倍受重视，相关的分子生物学研究得到迅速发展。本论文应用现代分子生物学和基因工程技术对家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNP的几丁质酶基因进行表达和表达产物对占￡杀虫剂的增效作用的研究。l、从基因组扩增了肋矾俨V几丁质酶全部编码区基因(chiA)和B／船VP

2、V缺失假定信号肽的几丁质酶的编码区基因(曲js-)。将ehi按其阅读框构建到pET28a原核表达载体T7强启动子下，得到pETchiA重组质粒。再将pETchiA转入大肠杆菌DE3中诱导进行融合表达，通过SDS—PAGE及Western印迹检测，确定表达出分子量为64kD左右的蛋白。薄层扫描显示，表达产物占细胞总蛋白的22％。2、将PCR扩增出的盘皿舻V曲is磅}因构建到杆状病毒一昆虫(Bac-to-Bac)表达系统的供体质粒pFASTBACHTb中，目的基因构建在多角体蛋白基因强启动子控制下，并与6

3、×Histag融合表达。通过转座作用将目的基因重组进穿梭载体Bacmid中，重组Bacmid曲is—DNA在Lipofeetin介导下共转染粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞系(Tn一581—4)。连续传代感染四次后，经PCR检测鉴定转染成功的重组病毒含有目的基因。对感染细胞进行SDS-PAGE分析及Western印迹检测，表明有特异性表达条带，其分子量为63kD左右。薄层扫描显示，表达产物占细胞总蛋白的12％。3、将以上Bm．NPV几丁质酶全部编码区基因(曲n)在大肠杆菌和删p矿缺失假定信

4、号肽的几丁质酶的编码区基因(this-)在昆虫细胞中的两种表达产物分别加入尉菌液中一起喂食2龄家蚕，观察并记录不同处理条件下家蚕的死亡时『白J及死亡时的体重，测算出其Lk和LT。，值。实验结果表明，取食了添加删矿表达产物的家蚕较对照处理相比，Lk死亡时间明显分别提前24．5h和25．6h，体重增量显著偏少。利用TDM模型综合分析，结果表明所得的两种表达产物对口f杀虫活性具有增效作用。关键词几丁质酶，励枷吖，秆状病毒，表达，昆虫细胞，大肠杆菌，Bt菌增效作用浙江夫学硕I’学位论文Cloningandcx

5、pressionofBmNPVchitinaseinE．coli＆insectcellsandthesynergisticeffectoftheexpressedproductswithBtonkillinginsectlarvaeABSTRACTBaculOVirusesarepathogentiCtoinsectSoftheorderLepldop[eraandareattractirebiologicalagentsforthecontrolofagriculturallYimportantin

6、sectpests．Thebaculovirus—insectsexpressionsystemiSoneofthepromiSingeucaryotiCsystemsinwhichalotofforeigngenesofeconomicvaluehavebeenelficientlyexpressed．ProgressinthefieldofbaculOVirusmolecularbiologyhavemadeWithmoreandmoreconcernstakentostudythebaculov

7、irusesinthenearingyears．ThiSdissertationcontainstwoaspectsconcerningBmNPVchitinasegeneexpressedinEc012andinsectcellSandthesynergisticeffectoftheexpressedproductswithBtonkillingtheinsect1arvae．1-Thecompletechitinasegene(cilia)andtheputatj_veSignalpeptide

8、—deficientencodingregion(Cflis一)wereamplifiedfrom胁妒yDNAbyusingPCRmethod．Thetargetgene(ciliA)WaSinsertedintotheexpressionvectorpET28a，underthecontrolofphageT7promoter．ThentherecombinantvectorpETch拍Wastransformedinto￡coli(DE3)forex