斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅱorf146基因的克隆与表达

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盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析盛晔1.2，闵丹1.2，李轶女2，张志芳2，朱越雄1，朱江1基金项目：国家自然科学基金（30770279）苏州市科技支撑计划项目(SNG0924)*通信作者。Tel:+86-512-65880278;E-mail:zjiang@suda.edu.cn作者简介：盛晔(1981-),男，常州市人，博士研究生,昆虫病毒分子生物学。E-mail:shegnye1981@163.com收稿日期：2010-07-21；修回日期：(1.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院，江苏苏州2151232.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081)摘要:【目的】研究斜纹夜蛾核型多角体病毒IIORF146基因的结构与功能。【方法】根据SpltMNPVIIORF146基因序列设计引物，经PCR扩增克隆ORF146基因。在生物信息学分析基础上进行启动子活性分析和转录时相分析。构建ORF146片段的原核表达载体，表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体。【结果】核苷酸序列分析表明，读码框含1383bp，编码460个氨基酸的蛋白质，推定分子量为50.4kD。启动子活性分析和转录时相分析都表明该基因是个早、晚期都表达的基因，在病毒感染8h和18h有两个转录峰，24h以后转录水平略有下降，但趋于稳定。pET-28a-ORF13原核表达的融合蛋白经纯化后制备的多克隆抗体特异性高，效价可达1:3200以上。【结论】SpltMNPVIIORF146基因是一个早期和晚期都表达的病毒组成型结构蛋白基因。推测ORF146基因可能与SpltMNPVII病毒感染宿主细胞后病毒DNA复制有关。制备的多克隆抗体可用于深入研究该蛋白的生物学特性与功能。关键词:斜纹夜蛾；核型多角体病毒；ORF146基因；原核表达；多克隆抗体中图分类号:Q933　　文献标识码:A　　文章编号:0001（6209）斜纹夜蛾(Spodopteralitura，Spli)又名莲纹夜蛾，俗称夜盗虫[1]，属鳞翅目夜蛾科的一种杂食性重要农业和林业害虫，危害植物共计109科389种，中国、日本、朝鲜、印度以及东南亚地区经常造成严重危害和巨大经济损失[2,3]。由于斜纹夜蛾的食性杂、世代重叠、抗性强，因此防治难度高，在各种化学合成杀虫剂严重污染环境以及害虫对化学合成杀虫剂抗性日益增强的情况下，生物防治愈显重要和迫切[4]。包括中国在内的各国学者，长期致力于发展核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus，NPV）生物杀虫剂来防治农业和森林害虫。斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）作为商品化杀虫剂已在我国一些地方推广使用，但杀虫作用的迟效性，宿主域窄等缺点是发展NPV生物杀虫剂的主要障碍，一些研究正试图通过分子生物学和基因工程技术来克服这些主要障碍[5,6]。从自然界中寻找和筛选新的高毒力的病毒株系是开发NPV生物杀虫剂的另一重要途径[7]。KamiyaK等本世纪初从日本全国各地野外感病幼虫收集、分离到189个SpltMNPV克隆，筛选并鉴定出三种基因结构类型(A、B、C)[8]。对上述三种基因结构型病毒DNA9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报限制性核酸内切酶酶切图谱的比较研究表明[8]，A型SpltMNPV与斜纹夜蛾的近缘种SpodopteralittoralisNPV(SLNPV-D)和SLNPV-B相似，B型SpltMNPV与在中国、日本、菲律宾的斜纹夜蛾(S.litura)幼虫中鉴定的SpltMNPV相似[9-11]，而C型SpltMNPV的与A型和B型的都不同。进一步的生物学特性和致病性研究表明，C型SpltMNPV的C3株是一种繁殖率和毒力极强的新的病毒变异株[8]。李轶女测定并分析了这一病毒株的基因组全序列(GenBank登录号:NC_011616)。通过与其他几种代表性杆状病毒基因组的比较，发现它与具有相同宿主来源的中国株SpltMNPVG2(SpltMNPVI)存在着非常显著的差异，却与甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeMNPV）比较接近。是一种新的具有重要研究价值的病毒变异株，故命名为SpltMNPVⅡ[12]。质谱分析表明，在SpltMNPVII的149个ORF中，ORF146是同时存在于ODV和BV中的功能未知的基因。本研究从该病毒基因组中克隆了ORF146基因，进行了序列分析、转录时相分析和启动子活性分析；并对ORF146基因进行了大肠杆菌融合表达，纯化了表达产物、制备了多克隆抗体。上述成果为进一步研究病毒基因组的变异与生物学特性的关系、侵染机制、研究和开发新的高效生物病毒农药打下基础。1.材料与方法1.1材料1.1.1病毒株、Spli细胞系、质粒和菌株SpltMNPV的C3株即SpltMNPVⅡ原始细胞纯化毒株由KamiyaK博士馈赠，本实验室保存。斜纹夜蛾TUAT-Spli221细胞由日本名古屋大学资源昆虫研究室MichihiroKobayashi教授提供，本实验室保存。载体质粒pMD-18TVector为TakaRa公司；表达载体pET-28a+、受体菌E.coliTOP10和BL21(DE3)由本实验室保存。1.1.2主要试剂和仪器1.2/方法1.2.1多角体纯化斜纹夜蛾细胞Spli用含10%FBS的TC-100培养基27℃培养。在斜纹夜蛾幼虫5龄初期注射感染细胞纯化毒株(BV)，让病毒在虫体内繁殖扩增。待其发病后收集感染病虫的尸体进行研磨，用蒸馏水反复清洗，利用差速离心的方法纯化多角体病毒[13,14]。1.2.2SpltMNPVⅡ基因组DNA的提取(1)取适量纯化好的多角体病毒，加入750μL裂解液(0.1mol/LNa2C03；0.17mol/LNaCl；0.01mol/LEDTA；pH10.5)，混匀后37℃下裂解lh；(2)用0.1mol/LHCl慢慢将溶液的pH调至8.0；(3)加Sarcosyl至终浓度为0.5％，ProteinaseK至终浓度为0.25mg/mL，混匀后37℃放置2h后，65℃放置2h；(4)用等体积的酚-氯仿进行抽提；(5)用2倍体积的冰无水乙醇沉淀DNA(-20℃，30min)；(6)用70％乙醇洗一次，然后晾干；(7)用适量0.1×TE溶解DNA沉淀，4℃保存备用[15]。1.2.3ORF146基因序列分析利用在线工具MotifScanonline(http://www.expasy.org/tools)(Falquetetal.，2002)分析蛋白序列信息，SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART)（http://smart.emblheidelberg.de/）(Schultzetal.，1998；Letunicetal.，2004)预测结构域，功能motif，翻译后修饰位点等信息。1.2.4ORF146启动子活性分析设计引物（5’pGL-146PFGACTCGAGAGCCAACCCAAGTATCAGT3’pGL-146PR5’9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报TCAAGCTTAATTTTGAATCTTACTAAAGTTCTACGC3’，下划线表示酶切位点）克隆ORF146基因上游300bp的启动子区，与pGL-3Basic连接得到质粒pGL3-146p。将1µgpGL3-146p用脂质体包裹后转染24孔板，每孔中有1×105Spli细胞，其中一份样品加SpltMNPVII病毒，一份不加。以转染pGL-3Basic作对照，平行重复三次，28℃培养48h后用Lucifraseanalysiskit（Promega公司）进行检测。1.2.5ORF146基因转录时相分析SpltMNPVII病毒以MOI=10感染Spli细胞，然后提取感染后不同时间点(0、2、4、8、12、18、24、36、48h)的总RNA。具体的操作步骤参考Trizol试剂产品操作说明进行。先收集每个时间点上的Spli细胞，加入lmLTrizol，剧烈振荡充分混匀后室温放置5min；加入0.2mL的氯仿充分震荡20sec，室温放置2min；4℃，12000r/min离心15min；取上清加入0.5mL的异丙醇，混匀后室温放置15min；4℃，12000r/min离心10min；沉淀以70%乙醇洗一次，室温晾干后溶于适量DEPC水中，-80℃保存。以紫外分光光度计(260nm)吸收值测定所抽总RNA的浓度。以OligodT为引物进行反转录，反转录反应条件：30℃10min；42℃lh，70℃15min；4℃5min，得到的cDNA以特异引物（P146-55’GCTACAACGAGATCGTCATAGATCG3’P146-65’CGGTATGAGGCGATAGTGAAAGTAC3’）和10ng总RNA的转录产物的cDNA为模板，以相当量的总RNA为对照进行RealtimePCR，反应条件为95℃3min；95℃20sec，58℃　20sec，72℃30sec，40个循环；熔解曲线从55℃到95℃，每0.5℃读取10sec。标准曲线制作:Realtime-PCR产物经电泳回收，测其OD260，由1OD260相当于50μg/mL双链DNA，用DNASTAR软件计算相应的分子量，计算出108个基因拷贝数所需回收产物的体积，并按每μL1011～107个拷贝进行梯度稀释作为标准样进行荧光定量PCR。以所得Ct值对相应的拷贝数的对数作图，即得各个基因扩增的标准曲线及其线性方程y=ax+b。对荧光定量PCR结果进行绝对定量分析，根据标准曲线方程计算x值，则待测基因的拷贝数Y=10x。1.2.6ORF146基因的原核表达以SpltMNPVⅡ基因组为模板，以（ORF146-1:5’CGAATTCTTGAAAGACGACGGTGTGT3’，酶切位点为EcoRI，下游引物ORF146-2:5’GAAGCTTCTATTCGACATGAGCAACAATCTG3’，酶切位点为HindⅢ）为引物克隆ORF146基因开读框部分约600bp的编码序列，扩增条件:94℃5min；94℃40S，58℃40S，72℃40S，31个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶回收法将PCR产物DNA片段回收，然后连接至pMD-18T，构建成重组质粒pMD18T-ORF146，并进行测序鉴定。经测序鉴定后再用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收目的条带，与原核表达载体pET-28a+连接，转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，得到表达载体pET-28a-ORF146，并再次双酶切鉴定。DNA连接转化、质粒制备与纯化、限制性核酸内切酶酶切均按Sambrook等方法进行[16]。重组的原核表达质粒pET-28a+-ORF146经鉴定正确后，将其转化大肠杆菌BL21，挑取单个菌落接种4mLLB培养基(Kan+)中，37℃继续振荡培养2h后(OD600值大约为0.6左右)，用IPTG终浓度为1.0mmol/L诱导表达目的蛋白，诱导时间分别为1、2、3、4、5h。收集菌体进行SDS-PAGE分析，分离胶和浓缩胶配制参照分子克隆手册第三版，浓度分别为15％和5％。电泳完毕后用考马斯亮蓝R-250染色2h，然后脱色直至蛋白质条带清晰可见为止。1.2.7pET-28a+-ORF146融合蛋白的纯化和鉴定大肠杆菌表达产物融合蛋白通过Ni-NTAHis-tag(上海闪晶分子生物科技有限公司)亲和柱纯化，9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报方法见其Ni-NTA树脂使用说明书。纯化产物通过SDS-PAGE，切成1mm3的小胶块进行质谱分析。质谱分析在中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室完成，方法为二级质谱的数据库搜索鉴定法（MS/MSDatabaseSearching）。1.2.8多克隆抗体的制备质谱分析鉴定正确后的纯化融合蛋白送中国科学院遗传与发育研究所，免疫豚鼠制备多克隆抗体。免疫共四次，每次免疫时间为十天，待四免结束后取血清即为目的蛋白的多克隆抗体。二抗和显色剂分别为羊抗豚鼠IgG-HRP和HRP-BAD底物显色试剂盒（北京博奥森公司)。1.2.9多克隆抗体效价及特异性的检测多克隆抗体的效价使用ELISA间接法测定；抗体特异性采用westernblot检测。2结果2.1　SpltMNPVIIORF146基因序列分析序列分析表明，该基因涵盖了1383bp的读码框，编码460个氨基酸，理论预测蛋白分子量为50.4kD。GenBank登录号为NC_011703。起始密码子ATG上游发现有一个TATAbox，位于-151nt处；在-59nt处，发现有一个晚期启动子基序ATAAG。SMART（SimpleModularArchitectureResearch，Tool，http://smart.embl-heidelberg.de/）分析结果显示，该蛋白在5-71位之间为HTH_XRE结构域，48-120位之间为PA2c结构域，54-187位之间为FBG结构域，60－91之间为ZnF_A20结构域，173-232之间为LIM结构域，188-409之间为PIPKc结构域。各结构域的功能参见表1。表1.SMART预测蛋白结构功能域Table1.PredictthestructuralandfunctionaldomainsusingSMARTDomainAminoacidsitesDomainfunctionHTH_XREPA2c5-7148-120InvolvedintranscriptionregulationPhosphatasebindingFBG54-187InvolvedinsignaltransductionZnF_A2060-91DNAbinding,zincionbindingLIM173-232ZincionbindingPIPKc188-409Kinasebinding2.2ORF146基因启动子活性分析Spli细胞转染pGL3-146p质粒48h后，用光量子计分别检测24孔板每个样品孔的光量子数ＣＰＭ，在不加SpltMNPVII病毒的样品组中，光量子数较对照组提高了近两倍，说明宿主细胞可以直接识别该基因的启动子，该启动子具有早期启动子的特性。在加SpltMNPVII病毒的样品组中，其光量子数有很大幅度的增加，高达15倍左右，说明该基因启动子的转录活性能被病毒编码的反式因子所激活（图1），因此，ORF146基因很可能是一个在病毒感染的早期和晚期都能有效表达的基因。9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报图1ORF146基因启动子活性分析Figure1promoteranalysisofORF146gene1.Mock2.TransfectingpGL3-146pDNAwithoutinfectionofSpltMNPVII3.TransfectingpGL3-146pDNAwithinfectionofSpltMNPVII2.3ORF146基因转录时相分析按材料与方法6作ORF146基因扩增标准曲线，得y=-3.2321x+42.975，R2=0.9965，标准曲线线性关系良好。以标准曲线算出ORF146基因以cDNA为模板和本底参照的扩增拷贝数，以拷贝数的lg值作Y轴，各时相分布作X轴，作图2。由图可见，在病毒感染8h和18h有两个转录高峰，24h以后转录水平略有下降，但趋于稳定。图2病毒感染后各时相ORF146转录变化趋势图Fig.2ThetranscriptionalchangestrendsoftheORF146gene2.4重组质粒pET-28a-ORF146的诱导表达以SpltMNPVⅡ基因组为模板，设计ORF146-1、ORF146-2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物先克隆到pMD18T载体，得到pMD18T-ORF146，测序鉴定后，进一步将目的片段亚克隆到表达载体pET-28a，得表达质粒pET-28a+-ORF146。PCR扩增及酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，均出现1条约600bp的特异条带（图3），构建载体测序结果与电子克隆获得的基因序列进行比较，结果表明两者完全一致，由此证明，成功克隆了SpltMNPVⅡORF146的部分序列ORF146。9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报图3ORF146部分序列的克隆与载体构建鉴定Fig3PCRandRestrictionanalysisofpET28a-ORF146M.DL2000DNAMarker1.PCRproductsofORF1462.RestrictionidentificationofpMD18T-ORF1463.RestrictionidentificationofpET-28a-ORF146重组质粒pET-28a-ORF146在大肠杆菌BL21中通过IPTG（1.0mmol/L）诱导融合表达，诱导时间为1、2、3、4、5h，结果表明在30kD下方有目的蛋白的融合表达(图4)。由于选取ORF146部分序列，ORF146的N端融合了His-Tag序列，融合蛋白的分子量应为27.6kD左右，所以表达的融合蛋白分子量与理论预测值相符，而且该条带是对照组（条带1和2）中所没有的。SDS-PAGE结果显示，在IPTG浓度为1.0mmol/L，目的蛋白在诱导1h时已开始表达，4h时后表达量已达最高。如图4所示，由于目的蛋白表达量较高，以包涵体的形式存在于胞内，经破碎后，都存在于包涵体沉淀中，上清中几乎没有。图4pET-28a-ORF146在BL21中表达的SDS-PAGE分析Fig.4AnalysisofORF146protienexpressedinBL21cellbySDS-PAGEM.ProteinMarker1.BL21withpET-28a2-7.InducedbyIPTGafter0、1、2、3、4、5h8.Supernatantaftercelllysis9.sedimentationaftercelllysis2.5纯化表达产物的质谱分析大肠杆菌表达产物融合蛋白通过NiNTAHis-tag亲和柱纯化后，通过SDS-PAGE切成1mm3的小胶块，进行质谱分析。经过二级质谱的数据库搜索鉴定法（MS/MSDatabaseSearching）分析（图5），结果显示，在XC值高达3.738时，每一段氨基酸片断仍至少有连续9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报15个氨基酸能够完全与目的片段的序列匹配，比可信最低标准的6个氨基酸多出9个氨基酸，而且有5段肽段能够匹配得上。能够检测出来的氨基酸序列与预期序列匹配率高达55.36%，所以能够确定纯化蛋白就是目标基因ORF146部分序列的表达产物。图5融合蛋白质谱分析结果图Fig5MS/MSDatabaseSearchingresults2.6ELISA检测多克隆抗体的效价待免疫四次豚鼠后，取少量血清用于ELISA检测抗体效价。将纯化的融合蛋白稀释至10μg/mL作包被抗原，用PBS将取得的豚鼠血清稀释至不同倍数:100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200，作为一抗，羊抗豚鼠IgG-HRP作为二抗，DAB为显色底物，ELISA间接法测抗体效价，免疫前血清作阴性对照，最后测定492nm处吸光值（扣除空管本底值，以稀释倍数为X轴，不同稀释倍数的492nm处吸光值平均值为Y轴作图。从图6可以看出，制备的多克隆抗体的效价可达1：3200以上。图6ELISA测定多克隆抗体效价Fig6Titredetermineofanti-ORF146antibodybyELISA图7westernblot测定多抗特异性Fig.7Westernblottinganalysisofanti-ORF146antibody2.7豚鼠抗ORF146多克隆抗体特异性测定将IPTG诱导的pET-28a-ORF146BL21菌液500μL，10000r/min离心取沉淀，加上样缓冲液，沸水浴5min，SDS-PAGE分析，然后以豚鼠抗ORF146多克隆抗体为一抗，以羊抗豚鼠IgG-HRP为二抗，进行westernblot，以HRP-BAD底物显色试剂盒显色。结果如图7，显色带单一，而且大小与预期分子量相吻合，表明多克隆抗体的特异性很好。3.讨论9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报对斜纹夜蛾核型多角体病毒SpltMNPVIIORF146基因的功能研究还未见报道。本文对ORF146基因进行了序列分析、启动子活性分析、转录时相分析、原核表达和多克隆抗体的制备。序列分析表明，该基因涵盖了1383bp的读码框，编码460个氨基酸，理论预测蛋白分子量为50.4kD。该基因起始密码子ATG上游发现有一个TATAbox，位于-151nt处，一个晚期启动子基序ATAAG，位于-59nt处。SMART分析结果显示了该蛋白可能存在有多个磷酸化位点，蛋白质磷酸化参与调节细胞多种生命活动过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢，肿瘤发生等，是细胞生命活动的调控中心[17,18]。生物体内磷酸化与去磷酸化是一个可逆的动态变化过程，当细胞中磷酸化蛋白质表达失调以及蛋白质磷酸化功能异常时，会引发一系列疾病。蛋白磷酸化可使蛋白质抵抗消化酶的作用，赋予蛋白质传导信号的功能并且对蛋白质正确折叠起着重要作用[19]。质谱分析结果显示该蛋白同时存在于ODV和BV中，而且蛋白丰度很高，推测其为病毒的组成型结构蛋白。启动子活性分析表明该基因的启动子同时具有早期和晚期启动子的特性。为了证实启动子活性分析的结果，又进行了转录时相分析，结果发现，感染后2h即有转录，并在感染后8h和18h分别有两个转录高峰。实验证明，启动子活性分析与转录时相分析的结果是一致的，该基因在病毒感染宿主细胞的早期和晚期都有表达。而且感染后期转录趋于稳定，为18h峰值的60%~70%，这更进一步证明该基因是一个病毒的组成型结构蛋白基因。转录时相分析在SpltMNPVII病毒感染宿主细胞8h和18h时有两个明显的高峰，这一现象与杆状病毒感染宿主细胞时的DNA复制的特征是一致的，推测ORF146基因可能与SpltMNPVII病毒感染宿主细胞后病毒DNA复制有关，参与早期BV的发生和晚期ODV的成熟两个过程。本实验还纯化了ORF146蛋白并制备了多克隆抗体。结合生物信息学分析，这些实验工作将有利于对该蛋白的进一步研究。如在宿主细胞中的定位，在病毒粒子中的定位，在细胞中的表达时相以及在虫体中的侵染途径等，将为进一步了解病毒侵染机制，研制高效价的生物农药奠定基础。参考文献:[1]梁东瑞，蔡毓能，刘岱岳，张起麟，胡远扬.中国昆虫病毒图谱[M].长沙:湖南科学技术出版社.1986，28.[2]秦厚国，汪笃栋，丁建.斜纹夜蛾寄主植物名录[J].江西农业学报(ActaAgriculturaeJiangxi)，2006，18(05):51-58.[3]姚文辉.斜纹夜蛾的生物学特性[J].华东昆虫学报(EntomologicalJournalofEastChina)，2005，14(2):122-127.[4]吕鸿声.昆虫病毒分子生物学[M].北京:中国农业科技出版社，1998.[5]0’ReillyDR，MillerLK.ImprovementofabaculoviruspesticidebydeletionoftheTGEgene[J].Biotechnology，1991，9:1086-1089.[6]KikhnoI，GutiérrezS，CroizierL，CroizierG.,andLopez-FerberM.L.Characterizationofpif，agenerequiredfortheperosinfectivityofSpodopteralittoralisnucleopolyhedrovirus[J].JGenVirol，2002，83:3013-3022.[7]Haas-StapletonEJ，WashburnJO，andVolkmanLE.P74MediatesSpecificbindingTargetsintheMidgutEpitheliaofHeliothisvirescensLarvae[J].JVirol，2004，78:6786-6791.9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报[8]KamiyaK，ZhuJ，MurataM，Laviña-Caoili,B.A.,Ikeda,M.,Kobayashi,M.,Kawamura,S.Cloningandcomparativecharacterizationofthreedistinctnucleopolyhedrovirusesisolatedfromthecommoncutworm，Spodopteralitura(Lepidoptera:Noctuidae)inJapan[J].BiologicalControl，2004.31(1):38-48.[9]Haas-StapletonEJ，WashburnJOandVolkmanLE.SpodopterafrugiperdaresistancetooralinfectionbyAutographacalifornicamultiplenucleopolyhedroviruslinkedtoaberrantocclusion-derivedvirusbindinginthemidgut[J].JGVirol，2005，86:1349-1355.[10]PijlmanGP，PruijssersAJPandVlakJM.Identificationofpif-2，athirdconservedbaculovirusgenerequiredforperosinfectionofinsects[J].JGVirol，2003，84:2041-2049.[11]FangM，NieY，WangQ，etal.Openreadingframe132ofHeliocoverpaarmigeranucleopolyhedrovirusencodesafunctionalperosinfectivityfactor(PIF-2)[J].JGenVirol，2006，87:2563-2569.[12]李轶女.东方粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒II基因组全序列分析[D].北京:中国农业科学院博士学位论文,2008.[13]OhkawaT，WashburnJO，SitaparaR.SpecificBindingofAutographacalifornicaMNucleopolyhedrovirusOcclusion-DerivedVirustoMidgutCellsofHeliothisvirescensLarvaeIsMediatedbyProductsofpifGenesAc119andAc022butNotbyAc115[J].JVirol，200579:15258-15264.[14]PangY，YuJ，WangL，HuX,BaoW,LiG,ChenC,HanH,HuS,YangH.SequenceanalysisoftheSpodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirusgenome[J].Virology，2001，287(2):391-404.[15]WuF，LavinaB，IkedaM，Laviña-CaoiliBA,IkedaM.CloningandbiologicalcharacterizationofSpodopteralitura(Lepidoptera:Noctuidae)innucleopolyhedrovirusisolatedfromChina[J].J.Seric.Sci.Jpn，2000，69(3):177-189.[16]SambrookJ，FritschE，ManiatisT.Molecularcloning:alaboratorymanual.2nded[M].NewYork:ColdSpringHarbor-LaboratoryPress，1989:53-85.[17]HongT，SummersMD&BraunagelSC.N-terminalsequencesfromAutographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirusenvelopeproteinsODV-E66andODV-E25aresufficienttodirectreporterproteinstothenuclearenvelope，intranuclearmicrovesiclesandtheenvelopeofocclusionderivedvirus[J].ProcNatlAcadSci,1997，94:4050-4055.[18]SambrookJ，FritschEF，ManiatisT.MolecularCloning:ALaboratoryManual(Nolan，C，ed).NEWYORK:ColdSpringHarborLaboratoryPress1989，53-85.[19]PijlmanGP，PruijssersAJP,VlakJM.Identificationofpif-2，athirdconservedbaculovirusgenerequiredforperosinfectionofinsects[J].JGenVirol，2003，84:2041-2049.CloningandexpressionofORF146geneofSpodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirusII(SpltMNPVII)ShengYe1，MinDan1，LiYinü2，ZhangZhifang2，ZhuYuexiong1，ZhuJiang1*1．CollegeofLifeSciences，SoochowUniversity，JiangsuSuzhou215123；I2．BiotechnologyResearchＩnstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081Abstract:【Objective】TostudythestructureandfunctionofanewlyfoundvirusstrainSpodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirusII(SpltMNPVII)ORF146gene.【Methods】InordertostudythefunctionoftheORF146,theprimersweredesignedaccordingtothesequenceofSpltMNPVIIgenome.ThepromoterofORF146wasamplifiedbyPCR.ThepromoteractivitiesanalysisandthetimecourseofmRNAtranscriptionanalysisweredone.ThefragmentoftheORF146genewasthenclonedintothevectorofpET28a(+)andexpressed.Thepolyclonalantibodywaspreparedbyusingthepurifiedfusionprotein.Titrationdeterminationof9 盛晔等：斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析/微生物学报anti-ORF146antibodywasevaluatedbyELISA.【Result】Nucleotidesequenceanalysisdemonstratedthatthisgenehasa1383bpORF，encoding460aminoacidswithapredictedmolecularweightof50.4kDa..BothpromoteractivitiesanalysisandthetimecourseofmRNAtranscriptionanalysisoftheORF146geneshowedthatORF146wastranscriptedinearlystageaswellasinlatestage,whichbegenit’stranscriptionat2hpostinfection(hpi)andreachedtwopeaksat8and18hpiandthenthetranscriptionlevelwasslightlydecreasedfrom24hpi.pET-28a-ORF146fusionproteinexpressedinprokaryoticandpurifiedpolyclonalantibodywasgoodspecificity,withthetiterof1:3200ormore.【Conclusion】SpltMNPVIIORF146geneisacompositionstructureprotein,whichwasexpressedatbothearlyandlatestage.ORF146mightinvolvedinviralDNAreplication.Thepolyclonalantibodycanbeusedtofurtherstudythebiologicalcharacteristicsandfunctionsofproteins.Keywords:Virus；Spodopteralitura；nucleopolyhedrovirus；ORF146gene；expression；polyclonalantibodySupportedbytheNationalNaturalScienceFoundation(30770279)SuzhouScienceandTechnologySupportProgramProject(SNG0924)Correspondingauthor.Tel:+86-512-65880278;E-mail:zjiang@suda.edu.cnReceived:2010-07-21/Revised:9