家蚕核型多角体病毒GD株空斑克隆株系的建立.doc

《家蚕核型多角体病毒GD株空斑克隆株系的建立.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、家蚕核型多角体病毒GD株空斑克隆株系的建立　　摘要：以家蚕胚胎细胞系(BmE-swUl)为病毒培养栽体。利用中性红染色的方法对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)GD株进行了空斑克隆，经扩大培养，获得了CD株空斑克隆株系。根据BmNPVc01株基因组序列的单核苷酸多态性(SNP)分析，选出其中SNP位点较多的gcn2(Generaleontrolnondere-pressible2)基因，用于验证BmNPvGD株空斑克隆株系的纯粹性。分别从BmNPVGD株和空斑克隆株的基因组中扩增gcn2基因，经pMD18-T克隆后测序；将两株病毒的gcn

2、2基因分别进行SNP位点分析。发现GD株grn2基因的潜在SNP位点有2个，而空斑克隆后的病毒株5条gcn2基因序列比较后均未发现多态性位点，说明空斑克隆株经纯化后，病原基因组的纯粹性获得了提高，病原得到了纯化。　　关键词：家蚕核型多角体病毒；空斑克隆；SNP住点：纯粹性　　中图分类号：S884.5+1；Q785　文献标识码：A　文章编号：0439-8114(2010)04-0785-03　　　　家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleo-polyhedrovirlls，BmNPV)属于杆状病毒科，是在昆虫病毒病中发现最早的一

3、类病毒。家蚕受此病毒侵染后，于病程的后期流出脓汁，俗称血脓病。长期以来，学者们致力于从基因、细胞水平研究病毒致病机理，期待彻底解决家蚕核型多角体病毒对养蚕业的影响。采用细胞空斑纯化方法获得遗传上均一的病毒株系，可保证分子生物学试验的准确性和惟一性，是深入探讨病毒遗传学和分子生物学特征的基础。家蚕核型多角体病毒分布广泛，不同株系的基因结构具有明显差异，通过比较NCBI数据库中BmNPVT3株和SC7株的序列得知。不同地区的BmNPV基因组序列存在一定的差异，齐义鹏等的研究发现，BmNPV中国株和日本株的uy39基因差异较大；作者的前期研究

4、也证实了不同株系BmNPVbro基因家族的构成差异显著；由此可知，该病毒变异性较大。为保证其基因组学研究的准确性，本文以BmNPV广东分离株(GD株)为材料，进行了空斑克隆，以获得纯化的病毒株；通过对BmNPV重庆株(CQ1株)基因组进行单核苷酸多态性(SNP)分析，选出SNP位点较多的gcn2基因用于验证BmNPVGD株空斑克隆株的病原纯粹性，即调查空斑克隆前与克隆后的病毒株中，这个基因的潜在SNP位点的变化情况。现将结果报告如下。　　　　1　材料与方法　　　　1.1　材料　　1.1.1　BmNPV病毒株与宿主细胞BmNPV广东株(G

5、D株)由华南农业大学蚕病实验室馈赠：家蚕胚胎细胞系(BmE-SWUl细胞)由西南大学蚕学与系统生物学研究所细胞实验室建立。　　1.1.2试剂　　Grace昆虫细胞培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自PAA公司；细胞培养板购自Corn.ing公司；PCR产物回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司：克隆载体pMDl8-T购自TaKaRa公司；低熔点琼脂糖、工具酶购自Promega公司。　　1.1.3PCR引物gcn2上游引物：5’-q’TCTGCCCATAGCGAGTG-3’；gcn2下游引物：5’-GACAACGCAGCATAGGGA-

6、3’：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。　　　　1.2　方法　　1.2.1BmNPV空斑克隆方法接种BmE-SWUl细胞于6孔细胞培养板中，待细胞均匀贴壁后。吸除培养基，加入病毒液，28℃吸附1h后，吸除病毒液，加入含1％低熔点琼脂糖和20％血清的培养基，封好培养板。28℃培养2-3d。加入中性红染液，28℃培养2-3h，然后吸除染液，倒置细胞板，黑暗过夜，以使空斑显现。空斑显现后，挑出空斑，于培养基中培养1h以上。4000r／min离心10min，上清作为下一轮空斑纯化的原液。经过4-6轮的空斑纯化，可形成BmNPVGD株空斑克

7、隆株系。　　1.2.2BmNPV基因组的提取采用碱裂解法进行提取。　　　　　　1.2.3PCR反应PCR反应体系为25μL，在Ep-oendorf仪上进行PCR反应，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s.53℃退火1min，72℃延伸2min.30个循环；72℃延伸10min，4cC保存。　　1.2.4单核苷酸多态性分析　　氨基酸序列翻译采用BioXM2.0软件进行处理，序列比对分析采用ClustalXl.83软件进行。　　　　2　结果与分析　　　　2.1　BmNPVGD株空斑克隆株系的建立　　利用中性红染色的方法进行空斑

8、纯化，活细胞着色，感染细胞不着色，染色4-5d后，得到分离良好的空斑(图1)，用枪头挑取空斑，放人150μL含有10％血清的培养基中.28℃培养1h以上，4000r／min离心，取上清，作为下一轮空斑纯化的