RNA干扰三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶基因的研究

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1、北京化工大学博士学位论文RNA干扰三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶基因的研究姓名：李晔申请学位级别：博士专业：生物化工指导教师：袁其朋20090605北京化工人学博士学位论文shRNA)序列及一条阴性对照序列，并定向克隆N4,干扰RNA(ShortinterferingRNA，siRNA)表达载体mU6pro上，分别命名为mU6proshRNA—carRA1，mU6proshRNA—carRA2，mU6proshRNA-carRA3和mU6proshRNA．control，通过双酶切与测序法鉴定得到的目的产物与预期一致。该质粒具有操作简单、成本低廉、靶向性好、作用时间长等优点。

2、对三孢布拉氏霉菌的原生质体制备及再生进行了系统研究。通过摸索菌体培养时间、酶种类、酶浓度、酶解pH、酶解时间、酶解温度、酶解方式、预处理方式等对三孢布拉氏霉菌原生质体形成和再生的影响，确定了原生质体制备的最佳条件：酶解体系为pH6．0的0．6mol／LNaCI配制的2％溶菌酶+3％纤维素酶+3％蜗牛酶的复合酶系，酶解温度为28。C，酶解方式采用75rpm振荡酶解，酶解时间为14h。在此条件下得到的原生质体制备率最高，为7．48x106原生质体／mL。原生质体再生结果显示，在0．7mol／LNaCl配制的PDA再生培养基上，采用双层平板培养法进行原生质体再生，得到的再生率较高

3、，再生平板可作保存菌种之用。成功建立了mRNA水平检测三孢布拉氏霉菌中RNAi效果的方法，包括RNA提取、PCR优化、RealTimePCR定量分析。首先建立了一种简单、有效的适合丝状真菌的RNA提取方法一改良异硫氰酸胍法，结果表明氯化苄能与多糖反应破坏真菌细胞壁，胞内RNA因细胞破裂而得以释放；乙酸钾和低浓度乙醇共同作用可去除绝大部分的多糖，且RNA样品完好。应用该方法所得的RNA产量较高，II摘要达到l10．71-tg／g，且OD260／OD280=1．93，OD260／OD230=2．27，说明RNA纯度符合要求，进一步通过RT-PCR和Northemblot证明此方

4、法得到了高质量的RNA。在此基础上结合实验设计与人工神经网络的方法优化了扩增体系及条件，建立了RealTimePCR技术定量分析carRA基因的方法，克服了SYBRGreenI荧光染料特异性差、定量不准的弊端。分析结果显示：mU6proshRNA．carRAl干扰质粒转染细胞后，carRA基因的表达量为未干扰组的43．2％，而mU6proshRNA．control阴性对照质粒转染细胞后，carRA基因的表达量为未干扰组的98．7％。因此从mRNA水平证明了我们构建的干扰质粒mU6proshRNA．carRAl对carRA基因的表达有明显的抑制作用。成功建立了蛋白水平检测三孢

5、布拉氏霉菌中RNAi效果的一套方法，包括特异性抗体制备、蛋白提取和Westernblot检测。鉴于三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶基因中含有太多稀有密码子，不能在大肠杆菌中将抗原高表达，无法用常规方法制备抗体。本文利用设计并合成抗原多肽的方法制备得到了三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶专一性抗体，效价高达l：32000。比较了三种蛋白提取方法，通过对蛋白产量和SDS．PAGE图谱进行分析，确定植物试剂盒法为最适蛋白提取方法，蛋白产量将近4mg／g，SDS—PAGE图谱中蛋白条带清晰且完整。并在此基础上建立了Westernblot技术定量分析番茄红素环化酶的方法，结果显示：与未干扰组相

6、比，mU6proshRNA．carRAl干扰质粒转染84h后，carRA蛋白表达量明显下降，而阴性对照组没有显著变化，从而在蛋白水平证明了我们构建的干扰质粒mU6proIII北京化工大学博十学位论文shRNA．carRAl对carRA表达有明显的抑制作用。成功建立了功能学水平检测三孢布拉氏霉菌中RNAi效果的方法。通过对原生质体形态及菌丝体形态的观察发现靶向carRA基因的shRNA干扰技术可以应用在三孢布拉氏霉菌中而不产生细胞毒性；通过对发酵后菌体生物量的检测说明该技术不影响细胞的存活与增殖；通过HPLC检测发酵产品的产量发现干扰carRA基因的表达可同时减少番茄红素、p

7、．胡萝卜素的合成，证实carRA基因有两个功能，即同时编码番茄红素环化酶和八氢番茄红素合成酶。最终从功能学水平证明了我们构建的干扰质粒mU6proshRNA．carRAl对carRA基因的表达有明显的抑制作用。关键词：RNA干扰，shRNA，三孢布拉氏霉菌，carRA基因IV摘要STUDYoNSILENCINGOFTHECARRAGENEBYRNAINTERFETRNCEINFILAMENToUSFUNGUSBLAK卫SLEATlUSPoRAABSTRACTThefilamentousfungusBlakeslea