甜瓜果实番茄红素-β环化酶基因的克隆、表达与遗传转化研究

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1、山东农业大学硕士学位论文甜瓜果实番茄红素--β环化酶基因的克隆、表达与遗传转化研究姓名：郝慧申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：于喜艳20120611山东农业大学硕士学位论文摘要甜瓜(CucumismelonL．)是世界上重要的园艺作物之一，果实含有大量的类胡萝卜素，其中B．胡萝卜素含量最为丰富。医学研究表明，类胡萝b素具有增强人体免疫力、防止心血管疾病和癌症等方面的重要作用。番茄红素D环化酶(LCYB)是甜瓜果实D．胡萝卜素合成中的关键限速酶。本论文通过高效液相色谱法(HPLC)测定了不同基因型甜瓜果实发育过程中B．胡萝卜素的含量，克隆了甜瓜果实Lcyb基因全长eDNA，并进行了

2、表达特性分析和遗传转化研究，以期为利用现代生物技术手段进行甜瓜品质改良奠定基础。主要研究结果如下：1．利用HPLC测定了两个不同基因型的甜瓜品种，即光滑黄皮白色果肉M01—3和绿色网纹橙色果肉‘Homoka’果实发育过程中p．胡萝卜素含量，结果表明，p．胡萝b素含量在两个品种果实发育过程中的变化趋势一致，果实发育前期含量很低，接近成熟时含量达到最大值，成熟后含量又下降。两个品种果实中B．胡萝卜素含量差别很大，‘Homoka’在果实成熟前期B．胡萝卜素含量最高，是M01．3的十几倍。2．根据GeneBank中登记的其它植物的Leyb基因保守序列设计兼并引物，利用RT-PCR及3’、5'R

3、ACE技术从M01．3甜瓜果实中克隆到Leyb基因，该基因全长1871bp，编码504个氨基酸，在GenBank中登记号为GU457407。3．利用RealTimeRT-PCR进行了Lcyb基因在甜瓜不同器官和果实发育阶段的表达特性分析，结果表明，Lcyb基因在M01．3和‘Homoka’根、茎、叶、花和果实中都有表达，在M01．3花中的表达量最高，在‘Homoka’成熟果实中的表达量最高。Lcyb基因在果实中的表达量随着果实的发育逐渐增加，M01．3在花后25天达到最大值，随后缓慢下降，‘Homoka’在花后45天达到最大值，果实成熟后又迅速下降。4．构建了甜瓜Lcyb基因的正、反义

4、表达载体，并利用农杆菌介导法对甜瓜进行了遗传转化，成功获得Kan抗性的转化苗。关键词：甜瓜；13一胡萝l、素；番茄红素13环化酶；克隆；遗传转化甜瓜果实番茄红素-p环化酶基因的克隆、表达与遗传转化研究ABSTRACTMelon(CucumismeloL．)isoneofthemostimportanthorticulturalcropsintheworld，itcontainsalotofearotenoids，especiallylB．-earotene．Medicalstudieshaveshownthatcarotenoidshaveimportantrolesinenhanci

5、nghumanimmunity,preventingcardiovasculardiseaseandcaneer．Leybisthekeyenzymeinthemeloncarotenoidbiosynthesispathway,andplaysakeyroleinthesynthesisofearotenoidsinmelon．Inthisstudy,wemeasuredIB-carotenecontentatdifferentdevelopmentalstagesofmelonfruitbyHPLC．WeclonedthefulllengthofmelonLcybeDNA．Weal

6、soanalyzedtheLcybexpressioncharacteristicanditsgenetictransformationtomelon．Themainresultsareasfollows：(1)IB-carotenecontentintwodifferentgenotypesmuskmelonfruitatdifferentdevelopmentstagesweremeasuredbyHPLC．Theresultsshowedthatinthefruitdevelopmentoftwogenotypes(M01-3，Homoka)，thereareverylittle

7、13-carotenecontentinearlymelonfruitdevelopmentandIB-carotenecontentrapidlyincreasedinnearlymaturefruitandfollowedbydeclinedaftermature．OrangefleshHomokahadthehighest13-carotenecontentinnearlymaturefruitandsignificantlyhigher