西瓜果实类胡萝卜素代谢相关基因的克隆、表达与遗传转化研究

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1、学校代码10459学号或申请号201111230118密级博士学位论文西瓜果实类胡萝卜素代谢相关基因的克隆、表达与遗传转化研究作者姓名：吕品导师姓名：赵文恩教授学科门类：工学专业名称：生物化工完成时间：2015年5月AdissertationsubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofDoctorCloning,ExpressionandGeneticTransformationoftheGenesinCarotenoidMetabolismPathwayinWatermelon(Citrulluslanatus)ByPinLvSupervisor:

2、Prof.Wen-enZhaoBiologicalChemicalEngineeringSchoolofChemicalEngineeringandEnergyMay2015学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规

3、定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日中文摘要中文摘要类胡萝卜素为以多个共轭的碳碳双键为生色系骨架的脂肪族或脂环族类型化合物，是由植物和微生物合成的一大类色素，因具有多种医学生物学功能而广受关注。西瓜（Citrulluslanatus）属于大众化水果之一，瓜瓤所具有的红

4、、粉红、黄、白等瓤色是由类胡萝卜素组成与含量的差异所致的，研究西瓜类胡萝卜素生物合成积累代谢，并进行遗传操作，探讨其抗肿瘤作用，可为西瓜类胡萝卜素的开发利用，进行西瓜营养育种和种质创新提供依据。本课题从基因水平上分析西瓜果实类胡萝卜素合成代谢的调控机制，并建立农杆菌介导的西瓜遗传转化体系，试图通过转基因技术对西瓜果实类胡萝卜素的成分进行改良。此外，本课题还对番茄红素和β-胡萝卜素抗肿瘤作用的分子机制进行研究。主要内容如下：利用RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中分离获得牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GGPS和八氢番茄红素合成酶基因PSY的cDNA全长序列，并通过生物信息学方法对其核酸及推导

5、的氨基酸序列进行分析。结果显示，（1）西瓜GGPS基因cDNA序列全长1,445bp（GenBank登录号：KF914758），开放阅读框为1,092bp，编码363个氨基酸，预测蛋白分子量约39kDa。西瓜GGPS氨基酸序列与同为葫芦科的甜瓜和黄瓜GGPS的同源性高达96%和95%。预测GGPS蛋白N末端存在一段52位氨基酸组成的转运肽信号序列。（2）西瓜PSY基因cDNA序列全长1,561bp（GenBank登录号：KC166870），开放阅读框为1,266bp，编码421个氨基酸，预测蛋白分子量约47.3kDa。西瓜PSY氨基酸序列与同为葫芦科的甜瓜和南瓜PSY的同源性分别高达95%和9

6、4%。预测PSY蛋白N末端存在一段43位氨基酸组成的转运肽信号序列，转运肽剪切后的PSY蛋白第209-231位氨基酸为一跨膜螺旋结构。种植四种不同瓤色的西瓜：红瓤“CN66”、粉瓤“CN62”、黄瓤“ZXG381”和白瓤“ZXG507”，采摘收集各发育和成熟时期（授粉后6天、12天、18天、24天、30天、36天）的果实样品，利用HPLC法检测类胡萝卜素的组成和含量，通过RT-qPCR技术分析类胡萝卜素代谢相关酶基因（GGPS，PSY，PSY-A，PDS，ZDS，CRTISO，LCYB，CHYB，ZEP，NCED1，NCED2和NCED3）的表达。结果显示，红瓤“CN66”和粉瓤“CN62”成

7、熟果实中主要含番茄红素，以及少I中文摘要量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、δ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素和紫黄质。其中，番茄红素在12DAP时出现，在此后的发育时期，其含量逐渐增加并成为主要的类胡萝卜素。在18-30DAP期间，“CN66”中大多数类胡萝卜素合成酶基因（包括GGPS）的表达量大幅增高，而代谢酶基因NCED1和NCED2的表达量较低，导致该时期类胡萝卜素的大量积累；黄瓤“ZXG38