中国水仙acs基因克隆与遗传转化研究

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1、福建农林大学硕士学位论文Abstract摘要本研究以中国水仙(Narcissustazettavar．chinensis)和转ACS反义基因的中国水仙试管小鳞茎为试验材料，进行如下研究：①叶片ACS基因同源克隆；②愈伤组织培养条件的优化；③初代转基因试管苗小鳞茎继代增殖和移栽。主要研究结果如下：1中国水仙叶片彳Cs基因的克隆采用申能博彩RNA试剂盒与TRIZOL试剂相结合的方法提取的总RNA，其完整性比较好、纯度高、量也较大，能够较好的去除多糖多酚，是提取中国水仙叶片总RNA行之有效的方法。应用同源克隆

2、结合RACE技术，获得中国水仙叶片ACS的eDNA片段1427bp，包含3’端17个poly(A)尾。该序列与登入GenBank的其他植物ACS基因有较高的同源性，序列分析发现该片段包含一个最大为1200bp的阅读框，编码400个氨基酸，TAA为终止密码子，已在GenBank上登录，登录号为GUl82503。2中国水仙愈伤组织培养条件的优化研究本试验以中国水仙鳞茎为供试材料，以鳞茎盘切块为外植体诱导愈伤组织，对中国水仙愈伤组织的培养进行研究，优化其继代增殖条件。在暗培养的条件下，采用对称分布的方式接种在

3、附加2，4．D1．0mg／L、KTO．1mg／L、BA0．5mg／L、309／L蔗糖的MS培养基上，最有利于中国水仙愈伤组织的培养。3初代转基因试管苗的继代增殖和移栽研究结果表明：初代转基因试管苗小鳞茎在附加6-BA2．0mg／L、2,4-D0．1mg／L和蔗糖309的MS培养基上培养，增殖率最高；1／2MS培养基附加NAA0．59／L和O．59／L活性炭最有利于转ACS反义基因中国水仙试管苗小鳞茎的壮苗生根；经预处理及选择经二次高压处理后的基质田园土：泥炭土=l：l为基质进行移栽能达到本试验研究的最好

4、效果。关键词：中国水仙；ACS；基因克隆；愈伤组织培养；遗传转化III福建农林大学硕士学位论文AbslractGenecloningofACSandgenetictransformationinN倪rcissustazettavat．chinensisAbstractInthisstudy,Chinesenarcissus(Narcissustazertavat．chinensis)andantisenseACStransgenicbulbletsofChinesenarcissuswereusedfo

5、rmaterialsforinvestigations硒follows：homologycloningofACSfromleaf；improvementofconditionsofcallusculture；subcultureandtransplantingofthefirsttransgenicbulblets．Themainresultswere私follows：1CloningofACSgenefromleafRNAkit(Solarbio)coupledwithTRIZOLwasusedfor

6、extractingoftotalRNA．TheresultsshowedthatintegrityoftotalRNAextractedbythismethodWasexcellent,high--yield,high·-purity,polysaccharidesandpolyphenolscouldberemovedefficiently．ThismethodWaseffectiveforextractingoftotalRNAfromleafofChinesenarcissus．eDNAofAC

7、SfromleafofChinesenarcissuswasclonedbyhomologycloningcoupledwithRACE．Itsfull·lengthWaS1427bp，andcontained17poly(A)atthe3'-end．ItWaShighlysimilarwithACSfromotherplantsinGenBank．Sequenceanalysisshoweditcontaineda1200bpORF,encoding400aminoacid，T从WaSthestopc

8、ondon．ItWaSregisteredinGenBank,andtheregisteredNO．WaSGU182503．2ImprovementofconditionsofcalluscultureSliversofChinesenarcissusbulbswereusedforinductionofcallus，andcultureconditionsofcallusofChinesenarcissuswasinvestigated,