DAPK基因启动子CPG岛异常甲基化在膀胱癌中的意义及其机制的研究

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1、复旦大学博士学位论文DAPK基因启动子CpG岛异常甲基化在膀胱癌中的意义及其机制的研究姓名：胡礼炳申请学位级别：博士专业：泌尿外科指导教师：王国民20070409论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：论文使用授权声明日期：本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件。允许论文被查阅和借阅；学校

2、可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名导师签名：日期：DAPK基因启动子CpG岛异常甲基化在膀胱癌中的意义及其机制的研究摘要膀胱移行细胞癌(Transitionalcellcarcinoma,TCO是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤。膀胱癌手术后约55％～60％的病例出现复发，其中16％～25％的肿瘤恶性程度增加【¨。膀胱癌术后复发和进展一直是困扰临床医生的难题，其术后的辅助治疗和长期随访也极大地增加了患者的医疗费用和痛苦。因此，探索膀胱癌发生发展的分子生物学机制和

3、遗传学本质，为肿瘤的靶向性治疗提供理论基础，是临床和科研上急需解决的重要课题。近年来的研究发现抑癌基因启动子区CpG岛(CGI)甲基化能阻碍该基因转录，是许多恶性肿瘤发生发展的重要原因。CGl异常甲基化是表观遗传学研究的重要内容B3l，DNA甲基化使肿瘤抑癌基因沉默也是Knudson's“两次打击论”中除杂合性缺失(LOH)外的重要内涵[41。死亡相关蛋白激酶(DeathAssociatedProteinKiaase,DAPK)定位于染色体9q34．1，是一种CaZ’／CaM依赖性的丝／苏氨酸蛋白激酶。研究发现DAPK可通过一系列通

4、路参与诱导凋亡的正向调节。DAPK在多种肿瘤细胞和组织中出现表达丢失，而且该表达缺失也与其cpo的甲基化改变密切相关阿。本研究在体外细胞水平和临床标本两个层面探讨DAPK基因cpG岛异常甲基化在膀胱癌中的意义和机制。首先采用RT-PCR和Wcstcm．blot检测三种不同膀胱癌细胞系(I"24，5637，ScaBER)中DAPK基因的表达状态，然后用BSP(b酬fitesequencingPCR)方法分析各细胞中DAPK基因启动子区cpG岛的甲基化状态。分别用甲基转移酶(DNMT)抑制剂5．aza．deoxycytid／ae和阿霉素

5、处理细胞后用上述方法检测DAPK的甲基化改变与基因表达的关系。用流式细胞仪检测不同处理组细胞的凋亡率，分析DAPK基因的表达与细胞凋亡之间的关系。体外转染DAPK基因至该基因表达缺失的T24细胞中，进一步研究DAPK基因在膀胱癌细胞的生物学功能。在细胞水平的研究基础上，选择临床正常膀胱粘膜上皮和膀胱肿瘤标本用MSP(methylationspecificPCR)方法检测不同组织标本中DAPK基因唧lG岛的甲基化状态，同时采用Western．blot和免疫组织化学染色来分析不同组织中DNMTl和DAPK的表达，探讨DAPK基因的甲基化

6、改变与肿瘤临床特点之间的关系和机制。第一部分人膀胱癌细胞中DAPK基因甲基化状态的分析人类基因组DNA中的cI'G岛处于甲基化压力和甲基化保护的动态平衡中。在某些目前尚不明确的因素作用下这种平衡被打破，甲基化逐渐由不影响基因表达周边区向决定基因转录的核心区扩散，经过一系列复杂的反应，最终使核小体结构变得紧密，阻止转录因子的结合，从而使基因表达沉默。DNA甲基化改变使抑癌基因沉默在肿瘤发生发展中具有意义，这是目前肿瘤表观遗传学研究的重要内容．本实验中，我们选择三种不同膀胱癌细胞(124，5637，S砷ER)进行体外实验研究．首先采用半

7、定量RT-PCR和Western．blot分别检测三种膀胱癌细胞中DAPK基因的表达。免疫荧光技术分析DAPK基因的亚细胞定位。用甲基化特异PCR(MSP)方法检测三种细胞中的DAPK基因启动子甲基化状态。观察甲基转移酶(DMNT)抑制剂5-aza．CdR(5．aza-C：dR)对各细胞中的基因表达和甲基化状态的影响。用流式细胞术检测细胞凋亡情况，并分析DAPK的表达与膀胱癌细胞凋亡的关系．结果发现T24细胞中未检测到DAPK基因的表达，也未检测到启动子甲基化：5637细胞中该基因表达水平极低，在ScaBER细胞中该基因的表达较前两

8、者要高。5637细胞和ScaBER细胞中均有甲基化改变。2．5umol／l浓度的5．aza-CAR作用72h可以有效上调5637和ScaBER细胞的DAPK基因的表达。流式细胞术检测发现5-aza-CdR处理细胞后，其DAPK表达上调