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《pten在胃癌细胞中的表达及其cpg岛甲基化状态的研究 》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、PTEN在胃癌细胞中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究刘芬,于皆平,邓全军,齐元玲,于红刚【摘要】 目的检测抑癌基因PTEN在四种胃癌细胞中mRNA和蛋白表达水平及其5’启动子区CpG岛甲基化状态。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MethylationspecificPCR,MSP)检测四种不同分化程度的胃癌细胞(HGC27,MGC803,BGC823,SGC7901)中PTEN基因启动子区域甲基化状态,RTPCR和GC803次之(两者间无显著性差异,P>0.05),HGC27表达水平最低(P0.01),其表达与细胞分化程度呈正相关趋势。结论
2、PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活,使其蛋白表达减少甚至缺失,这可能是导致胃癌发生、发展的原因之一。【关键词】胃癌 PTEN基因 甲基化 StudyingtheExpressionofPTENandItsCpGIslandMethylationStatusinGastricCarcinomaCellsDepartmentofGastroenterology,RenminHospitalofethodsUsingmethylationspecificPCR(MSP)techniquetodetectmethylationstatusofPTEN
3、genein4differentdifferentiationgastriccancercells(HGC27,MGC803,BGC823,SGC7901),RTPCRandethylation 胃癌的发生涉及癌基因功能增强,抑癌基因突变或功能缺失。作为第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因PTEN(PhosphatesandTensionhomologdeletedonchromosomeTen),在多种肿瘤中存在失活现象,其失活的原因除突变、缺失外,5’CpG岛异常甲基化可能是其失活的第三条途径。本研究采用敏感的甲基化特异性PCR(MSP)方法检测PTEN基因启
4、动子在四种不同分化程度的胃癌细胞中的甲基化状态,并通过RTPCR和GC803,BGC823(低分化),SGC7901(中分化)购自上海生命科学研究院。1.1.2主要试剂Trizol试剂盒,RPMI1640培养基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);亚硫酸氢钠,氢醌,鼠抗人βactin抗体,硝酸纤维素膜(Sigma公司);I1640培养液(pH7.2),在37℃、5%的CO2培养箱中培养。1.2.2RTPCR检测PTENmRNA水平Trizol一步法提取细胞总RNA,经逆转录后再以cDNA为摸板扩增。PTEN基因和βactin的引物序列,见
5、表1。PTENPCR反应条件:94℃3min,以94℃30s,54℃30s,72℃45s循环20次,72℃延伸7min;βactinPCR反应条件:94℃3min,以94℃40s,56℃45s,72℃60s循环20次,72℃延伸7min。1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照并检测吸光度值,将PTEN与βactin吸光度比值作为其mRNA水平的相对值。重复实验6次,取均值。1.2.3(终浓度160μM),1×NEBuffer2和1U的Sss1酶共同37℃孵育2h后再经亚硫酸氢钠修饰;完全未甲基化对照仅用亚硫酸氢钠处理;阴性对照分别用没有经亚硫酸氢钠处理的DNA
6、和H2O代替模板DNA进行PCR。1.2.5MSP引物设计根据PTEN基因序列(GenBankaccessionnumberAF143312),MethPrimer软件,并参照SalvesenHB,KangGH,KangYH等[24]合成,见表1。25μlPCR反应总体系为:10×Taq酶Buffer2.5μl,dNTP2.0μl(终浓度200μM),Taq酶0.5μl(1u),上下游引物各25pmol,MgCL1.0μl,模板DNA2~3μl,补足水至25μl。反应条件为:94℃热启动11min后开始35个循环:94℃40s,63℃45s,72℃1min,最后于7
7、2℃延伸12min,4℃保存。产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溴化乙锭染色后在紫外光下观察,凝胶成像系统拍照。1.3统计学分析所有数据用±s表示,用SPSS11.5软件进行统计学分析,P0.05为差异有显著性。2结果2.1PTENmRNA和蛋白表达水平见表2。mRNA和蛋白水平SGC7901细胞显著高于HGC27细胞(t=18.1536,P0.01)及MGC803和BGC823细胞(t=9.010,P0.01;t=7.4567,P0.01),后两者显著高于HGC27细胞(t=9.14,P0.01;t=10.697,P0.01),但是MGC