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1、探讨DAPK基因甲基化在NSCLC检测中的临床意义1.沈阳医学院附属第二医院呼吸科M0002；2.沈阳医学院附属第二医院消化科110002【摘要】目的：探讨DAPK基因甲基化在NSCLC检测中的临床意义。方法：采用基因测序法检测68例NSCLC、30例肺部良性疾病患者、15例健康体检者血清中DAPK启动子区域甲基化状况，分析其与临床特征的关系。结果：NSCLC患者DAPK甲基化检出率为39.70%,而肺部良性疾病患者和健康体检者未检出(P<0.05)o结论：DAPK基因甲基化可能被作为检测肺癌发生和发展的重要生物学指标。【关键
2、词】DAPK基因；非小细胞肺癌；甲基化肺癌是当今导致肿瘤患者死亡的主要原因，其中，非小细胞肺癌(Non-small-celllungcancer,NSCLC)是最常见的癌症致死原因之一。己有研究表明，表观遗传学在NSCLC的发牛和发展过程中起着重要作用。目前发现与人类疾病密切相关的表观遗过程主要有DNA甲基化、基因突变、DNA复制相关、染色体失活、非编码RNA等,其中，死亡相关蛋白激酶(Death-associatedproteinkinase,DAPK)是近年来新发现的抑癌基因，它是一种促凋亡丝氨酸/苏氨酸激酶，是参与凋亡过程的新
3、型候选抑癌基因，在头颈部鳞癌⑴和胃癌⑵等肿瘤的发生、发展中起重要作用。木研究旨在探讨DAPK基因甲基化在NSCLC检测中的临床意义。1资料与方法1.1临床资料选择2014年9月・2015年12月于我院住院治疗的NSCLC患者68例，势42例、女26例，平均年龄55.5岁。均经组织病理学或细胞学证实，其中鳞癌29例、腺癌39例。TNM分期I期1例、II期13例、III期27例、IV期27例，均未行放化疗。肺部良性疾病患者系我院呼吸科同期住院治疗的30例患者，其中肺部感染10例、慢性阻塞性肺疾病12例、气胸8例；15例健康志愿者为我院体
4、检者。1.2方法采集受试者清晨空腹静脉血5ml,4°C静置2h,离心分离血清，・80°C保存。采用QIAampBloodMiniKitDNA抽提试剂盒(QIAGEN公司，德国)提取血清DNAo将所提取的DNA中加入1μg鮭鱼精DNA(Sigma公司)作为载体，以终浓度为0.3mol/L的NaOH于40°C反应15min变性解链，依次加入新鲜配制的对苯二酚30μl和pH5.0的NaHSO3520μl,轻柔混匀，以石蜡油覆盖,55°C避光反应14h。吸除石蜡油，提纯DNA,以终浓度为0.3mol/L的NaOH于室温处理
5、lOmin脱硫，最后冷乙醇沉淀，所得DNA溶于30μl灭菌去离子水中，・80°C保存。分别识别甲基化特异性(M)和非甲基化特异性序列(U)oDAPK具体序列为：M正义引物：5-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3,M反义引物：5-CCCTCCCAAACGCCGA-3；扩增产物大小98bp。U正义引物：5-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3,U反义弓I物：5-CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3；扩增产物大小106bp。PCR反应体系20μl,其中去离子水14.95μ
6、l,10×PCR缓冲液2μl,MgCI2(25mmol/L)1.2μl,dNTPs(10mmol/L)0.25μl,上下游引物各0.2μl,修饰后的DNA模板lμl,TaqDNA聚合酶(10U/μl)0.2μl,充分混匀后置DNA扩增仪中扩增。反应条件为：94°C预变性2min,94°C变性30s、62°C退火40s、70°C延伸40s,共33个循环，最后70°C延伸lOmino将PCR产物经QIAquickPCR产物纯化试剂盒(QIAGEN公司，德国)纯化后，送上海生工公司进行
7、测序。1.3统计学方法采用SPSS12.0统计软件，定量资料采用t检验，分类资料采用χ2检验或Fisher精确概率法检验。P<0.05为有统计学差异。2结果68例NSCLC患者中，27例血清DNADAPK基因甲基启动子区域CpG岛发生异常的过度甲基化，检岀率为39.70%；而良性肺部疾病患者和健康体检者血清未检出DAPK基因甲基化，差异有统计学意义(P<0.05)o3讨论DNA甲基化指DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)催化S・腺昔甲硫氨酸作为甲基供体，将CpG二核昔酸宁端的胞喘
8、喘转变为宁甲基胞喀卩定的过程。这种过程并没有改变基因序列，但能引起染色质结构、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达［3］。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达，在疾病发生吋，肿瘤细胞全基因组低
