子宫内膜癌组织中fhit基因启动子区域cpg岛甲基化状况的研究

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1、子宫内膜癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛甲基化状况的研究【关键词】子宫内膜　摘要目的:检测子宫内膜癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化状况，分析其与临床病理特征之间的关系，探讨FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化在子宫内膜癌发生发展中的作用。方法:采用甲基化特异的PCR方法对亚硫酸氢盐修饰过的35例子宫内膜癌组织、癌旁组织及患者自身外周血白细胞DNA和20例非癌患者子宫内膜组织DNA的FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化状况进行分析。结果:癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化率为25.71%，癌旁组织和外周血中也存在相似的甲基化率。非癌患者的子宫内膜

2、组织中FHIT基因的CpG岛无甲基化。癌组织与非癌患者子宫内膜组织的甲基化率之间的差异有统计学意义（P<0.05）。DNA甲基化与临床病理特征之间无相关性。FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化为子宫内膜癌发生中的早期事件。结论:子宫内膜癌组织中存在FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化，CpG岛的甲基化与临床病理特征之间无相关性。DNA甲基化为子宫内膜癌发生中的早期事件。癌旁组织和外周血可用于癌相关基因启动子区域CpG岛甲基化的检测。关键词子宫内膜癌;肿瘤抑制基因;DNA甲基化;MSP;FHIT子宫内膜癌（endometrialcarcinoma，EC）是女性生殖器官最常见的恶

3、性肿瘤之一，其发病率近年在世界范围内呈上升趋势［1］。从分子水平探讨子宫内膜癌的发病机制，是近年来妇科肿瘤研究中的热点。现有研究［2］已确切证明DNA甲基化是肿瘤抑制基因（tumorsuppressorgenes，TSGs）失活的第三种机制，而且在某些情况下是抑癌基因失活的唯一机制。为此，我们对子宫内膜癌组织中FHIT基因启动子区域CpG岛的甲基化（简称启动子甲基化）状况进行检测，以分析探讨其在子宫内膜癌的发生发展中的作用。1资料与方法1.1临床资料选取山东大学齐鲁医院妇科2003年1月～2003年10月间临床病理资料完整的35例子宫内膜癌手术病人的子宫内膜癌组织标本，病理类型参

4、照国际妇科病理协会（ISGP）1988年制定的标准分为:子宫内膜样腺癌27例占77.14%，非腺癌8例占22.86%（透明细胞癌4例，腺鳞癌3例，未分化癌1例）。手术-病理分期和病理分级按国际妇产科联盟（FIGO）1988年制定的标准分为:Ⅰ期24例占68.57%（Ⅰa期2例，Ⅰb期18例，Ⅰc期4例），Ⅲ期11例占31.43%（Ⅲa期6例，Ⅲc期5例）;G112例占34.29%，G214例占40.00%，G39例占25.71%。绝经前患者5人占14.29%，绝经后患者30人占85.71%。所有患者术前均未接受放疗、化疗或激素治疗。子宫内膜癌患者的发病年龄为43岁～73岁，平均年

5、龄（57.6±6.9）岁，中位年龄57岁。35例子宫内膜癌中，12例同时采集了癌旁正常组织，其余23例则提取自身外周血白细胞DNA，同时用于甲基化检测。另收集功血或不孕症患者刮宫所得的子宫内膜组织标本20例用作正常对照，其年龄为25岁～59岁，平均（41.9±13.6）岁。对照组子宫内膜组织的病理类型包括月经期、增生期、分泌期子宫内膜和单纯性增生子宫内膜。所有病理诊断均由同一名病理学专家复查并核实。1.2实验方法1.2.1标本的留取和DNA的提取:肿瘤患者的组织标本于术中子宫离体后即刻按无菌原则采集，并立即冻存于-80℃冰箱中待用。抗凝外周血采集后立即离心，使之分为血浆和白、红细

6、胞三层后-80℃冻存。刮宫所得子宫内膜组织标本也于术后立即采集并于-80℃冻存。组织标本DNA的提取方法按Roche公司HighPurePCRTemplatePrepa-rationKit的说明和程序操作，外周血标本DNA的提取按Qiagen公司的产品说明和程序操作。1.2.2DNA的修饰方法:每份样本取1μg/100μL的DNA100μL按Intergen公司的CpGenomeDNAModificationKit说明和程序对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。1.2.3甲基化特异性PCR（MSP）:12.5μL热启动PCR的反应体系包括去离子水，10×PCRbuffer，2.5mMMgC

7、l2，2.5mMdNTP，AmpliTaq-Gold酶（PE公司，5u/μL）及修饰过的DNA模板。PCR循环参数为:预变性，95℃，10min;变性，94℃，30s;退火，68℃，45s;延伸，72℃，45s;45个循环后，72℃延伸10min。引物（由香港中文大学癌症中心惠赠）序列为:甲基化引物M-F:TTGGGGCGCGGGTTTGGGTTTTTACGC，M-R:CGTAAACGACGCCGACCCCACTA;非甲基化引物U-F:TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTT