宫颈癌细胞fhit基因启动子cpg岛甲基化状态分析

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1、宫颈癌细胞FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态分析【摘要】FHIT基因是一种与凋亡有关的肿瘤抑制基因，广泛存在于各种细胞凋亡系统中，在多种肿瘤及细胞系中失活，其启动子部位CpG岛甲基化是FHIT基因失活的主要机制之一。本研究应用甲基化特异性PCR(MethylationspecificPCR，MSP)对不同宫颈鳞癌细胞系FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态进行检测，在分子水平上了解FHIT异常甲基化与宫颈癌的相关性，为宫颈癌去甲基化治疗提供依据。【关键词】宫颈癌；FHIT基因；甲基化PCR　　DetectionofMethyl

2、ationoftheFHITPromoter5'CpGinHumanCervicalCancerCellLines　　Abstract：The5'CpGislandmethylationofFHITgenehasbeendetectedinmanycarcinomas，anditmaybearosesinactivationonFHITgene.Suchlittledetailsonmethylationstatusof5'CpGislandofFHITgeneincervicalcancercellwerereporte

3、d，sothisstudywasdesignedtoexploremethylationstatusof5'CpGislandofFHITgenein6cervicalcancercelllines.Wewanttorevealtherelationshipbetween6FHITgeneandtumourigensisand/ordevelopmentinhumancervicalcancer.　　Keywords：CervicalCancer；Fragilehistidinetriad(FHIT)gene；Methyla

4、tionspecificpolymerasechainreaction(MSP)　　国内外有关宫颈癌与FHIT基因启动子区甲基化的研究报道不多，结论尚不一致。Herman［1］等1996年建立的异常甲基化检测方法(MSP)具有灵敏度高、特异性好、操作简便的特点。本研究拟应用MSP技术分析人宫颈癌细胞株FHIT基因5'端CpG岛甲基化水平，旨在揭示FHIT基因甲基化对人宫颈癌发生的影响，为寻找宫颈癌诊断和治疗的新方法提供理论和实验依据。　　1材料与方法　　1．1材料SiHa、C41、Hela、RJC1、CS1213以及C3

5、3A细胞株为西安交通大学第一附属医院临床分子生物学中心保存。　　1.2主要试剂RPMIMedium1640为美国GIBCO公司产品；热启动Taq酶、HaeⅢdigestDNAMarker购于日本Takara公司；亚硫酸氢钠、氢鲲购于美国Sigma公司。FHIT甲基化扩增引物序列:F5_6TTGGGGCGCGGGTTTGGGTTTTTACGC3；R5_CGTAAACGACGCCGACCCCACTA3，扩增产物长度为74ｂｐ；非甲基化扩增引物序列扩增产物长度为F5_TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG3

6、；5_CATAAACAACACCAACCCCACTA3；两组引物由上海生工生物公司合成。　　1.3方法　　1.3.1提取样品常规细胞复苏、传代、收集细胞，-70℃保存。QiagenDNeasyTissuekit提取细胞基因组的DNA。取2μlDNA样品加入98μlTE缓冲液稀释，经核酸蛋白分析仪测定260nm和280nm处的吸光度，若比值在1.8～2.0之间，说明样品中的核酸较纯。　　1.3.2亚硫酸氢盐修饰双蒸水稀释2μgDNA至10μl，加入3mol/LNaOH1.1μl混匀；37℃水浴170min～20min；加入1

7、0mmol/L氢鲲6μl，轻轻摇匀；加入3.6mol/L亚硫酸氢钠（pH5.0）104μl，轻轻混匀；至于PCR仪中，55℃温浴18h(过夜)；置于-20℃保存。　　1.3.3PCR反应及产物检测94℃3min、94℃30s、65℃30s、72℃30s、40个循环、72℃延伸7min。取5μlPCR产物与1μl6LoadingBuffer混合，上2％琼脂糖凝胶（0.5TBE），90V电泳206min，并以作为分子量参照标准进行产物鉴定，凝胶成像分析系统分析并照相。　　2结果　　6个宫颈癌细胞株中，SiHa、C41、Hela、

8、C33A甲基特异性引物和非甲基特异性引物均扩增扩增出73bp的目的条带，呈现出甲基化杂合性状态，而RJC1、CS1213细胞仅甲基化引物扩增出了目的条带，非甲基化引物未扩增出目的条带，表现为完全甲基化状态。　　3讨论　　引起基因表达异常主要有遗传学和表遗传学两种机制。后者可