舌癌患者p16基因启动子CpG岛甲基化及其与临床病理的关系.pdf

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1、广东医学2015年1月第36卷第1期GuangdongMedicalJourn~Jan．2015，Vo1．36．No．1·97·舌癌患者pl6基因启动子CpG岛甲基化及其与临床病理的关系米林曦，黄旋平，吴忆霖，徐华生广西医科大学附属口腔医院口腔颌面外科(南宁530021)【摘要】目的研究舌癌与pl6基因启动子区域的CpG岛甲基化的潜在关系，并了解pl6基因甲基化与临床病理的关系。方法观察组舌癌标本及对照组正常舌组织标本所提取的DNA，经亚硫酸氢钠处理改变甲基化碱基，设计相应引物(pl6一M、p16一u)Q—MSP扩增，检测样本中的甲基化比例。结果观察组甲基化阳性率为64．5

2、8％(31／48)，对照组阳性率仅2．08％(1／48)，差异有统计学意义(P<0．05)；舌癌个体中pl6基因甲基化比例与病理分期、发生淋巴转移、组织学分化程度相关，与年龄、性别无关。结论pl6基因启动子CpG岛甲基化现象与舌鳞癌的发生发展关系密切；癌症发展越晚期、肿瘤浸润更深、发生转移、更低分化者p16基因启动子CpG岛甲基化的频率更高，但与患者年龄、性别等因素无关。【关键词】舌鳞癌；pl6基因；甲基化；临床病理研究表明，肿瘤抑制基因的CpG序列发生甲基化稀释倍数，数据与分析仪结果核对，确认操作液浓度。可能导致基因失活，pl6基因作为抑癌基因的一种，其1．3亚硫酸氢钠处

3、理DEPC处理水调配总含量为2启动子CpG岛甲基化引起的基因失活将会导致D1蛋g的各份DNA样品液。按照EZDNAMethylation—白表达过度，致使pRb磷酸化，游离DNA合成转录因GoldKit(ZYMO)说明调配液态CTConversionReagent，子E2F激活，从而反复进入有丝分裂期导致恶性增殖，每PCR管中加入130IxL的CTConversionReagent和增加癌变的可能。既往国内外关于舌癌与pl6基因甲2OIxLDNA样品，如DNA样品体积小于20L，则用水基化专项研究鲜见，且对与舌癌相关的主要基因异变来补差。经变温水浴解链，用Zymo—Spin

4、ICColumn类型暂无定论。本研究采用甲基化特异聚合酶链反应过滤管在10000r／min离心下依次过滤与试剂反应的(methylationspecificPCR，MSP)的荧光改进方法Q—DNA样品，最终所得亚硫酸氢钠处理的DNA样品投入MSP以提高结果的准确性和可观性，并对舌癌中甲基下一步骤实验使用。化比例与临床病理参数的相关性进行了分析，意在弥1．4引物设计OligoPrimerAnalysis软件设计pl6补国内外该领域研究的空白区。基因甲基化后相应引物(Primerpl6一M)与pl6基因未1资料与方法发生甲基化的相应引物(Primerpl6一U)。pl6一M正义

5、链引物序列：5一1-rA，rrAcAGGGTGGGGcGGATcGc一1．1一般资料观察组均来自于广西医科大学附属3，反义链序歹0：5一GACCCCGAACCGCGACCGTAA一口腔医院行手术治疗并常规病理切片检查确诊为舌鳞3；pl6一U正义链引物序列：5一TI'ATrAGAGGGT-状细胞癌的癌组织标本48例，患者年龄36～70岁，平GGGGTGGAT]'GT一3，反义链序列：5一CAACCCCAAA—均(45．3±1．75)岁，其中男24例，女24例。组织学分CCACAACCATAA一3。化程度：高分化30例，中分化15例，低分化3例。对1．5Q—MSP20的PCR反

6、应体系包括SYBR照组为来自舌外伤后所取及舌黏液囊肿患者中患区边PremixExTaq(2×)10L，特异性引物m的上游序列缘正常舌组织共48例，其中舌外伤来源22例，舌黏液和下游序列各0．4txL(甲基化体系)或特异性引物u囊肿旁正常舌组织26例(标本采集取得患者同意)。的上游序列和下游序列各0．4fxL(非甲基化体系)，1．2提取组织DNA试剂取观察组及对照组的舌癌dHO7．2txL。配好的PCR反应液每孔分装18，按组织或者正常舌组织3g，置研钵于液氮中磨碎处理成顺序加标本DNA液各2IxL。置StepOne荧光PCR扩液，10000r／min离心1min，倒上清液留

7、底液，底液按增仪上，反应条件95cI=预变性10S，95℃变性5S，65℃试剂盒TIANampGenomieDNAKit说明提取DNA。提退火／延伸20S，40循环。各组均加入阴性对照，阴性取物经核酸分析仪NANODrop2000测定OD值，该值在体系未加入DNA。1．7～1．9之间，据公式DNA浓度(ng／IxL)=Am×50×1．6统计学方法采用SPSS19．0统计软件，观察广西医疗卫生重点科研课题资助项目(编号：桂卫重2011033)组、对照组、阴性对照组在荧光PCR仪上定性检测观广西高校科学技术研究项目(编