新孢子虫侵入对宿主细胞egfr信号通路的作用

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1、新孢子虫侵入对宿主细胞EGFR信号通路的作用RegulationofhostcellsEGFRsignalingpathwayduringtheprocessofN.caninuminvasion作者姓名：边征征专业名称：预防兽医学指导教师：李建华教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月6日本研究得到“国家重点基础研究发展计划（973计划）”（编号：2015CB150300）、吉林省科技发展计划项目（资助号20130521005JH）、吉林省长白山学者和国家质检公益性行业专项（201410061）资助Projectsupportwasp

2、rovidedbythe“NationalKeyBasicResearchProgram(973Program)ofChina”(GrantNo.2015CB150300),(20130521005JH)、ChangbaiMountainscholarsofJilinProvinceandtheSpecialFundforQualityDetectionResearchinthePublicInterestinChina(201410061)中文摘要新孢子虫侵入对宿主细胞EGFR信号通路的作用新孢子虫病是由新孢子虫寄生在宿主机体内引起的原虫病

3、，呈世界性分布。新孢子虫可感染犬、牛、羊、马、鹿和狐狸等多种动物，并引起脑膜脑炎、多发性肌炎、神经根神经炎以及孕畜的流产、死胎、木乃伊胎和新生儿的运动障碍等。对畜牧业和养殖业造成重大的经济损失。EGFR信号通路是生命活动中重要的信号通路，调节细胞的增殖、凋亡、迁移、存活等一系列复杂的过程。研究发现弓形虫感染早期可激活宿主细胞EGFR信号通路，阻止自噬蛋白对弓形虫的杀伤。但新孢子虫侵入对宿主细胞EGFR信号通路的作用尚未见报道。本研究通过新孢子虫速殖子体外培养方法建立、速殖子侵入对宿主细胞EGFR信号通路的激活和抑制EGFR信号通路分子对速殖子

4、侵入的影响的系统研究，阐明新孢子虫侵入对宿主细胞EGFR信号通路的调控和该通路在虫体侵入过程中的作用，对揭示新孢子虫与宿主互作机制、致病机制等具有重要学术价值和科学意义。主要研究内容如下：新孢子虫速殖子体外培养分别用293T、HCT-8、Hela和Vero细胞培养新孢子虫速殖子，观察并计数速殖子数量和绘制生长曲线。吖啶噔染色并用激光共聚焦显微镜观察细胞内速殖子。结果表明，新孢子虫速殖子可以在293T、HCT-8、Vero和Hela细胞中培养。在293T、HCT-8和Vero细胞中生长较快，感染的第3天开始增多，分别在第5、7和6天达到高峰。而

5、在Hela细胞中速殖子生长较慢，虫体数量一直处于较低水平。在293T、HCT-8和Vero细胞中纳虫泡较大且速殖子数量较多，而在Hela细胞中纳虫泡较小且速殖子数量较少。为新孢子虫速殖子体外培养提供新的细胞系—293T和HCT-8。新孢子虫侵入对宿主细胞EGFR信号通路的激活在虫体感染293T细胞后，不同时间（10min、20min、30min、60min）收集细胞，提取细胞总RNA和总蛋白，分别用RealtimePCR和WesternBlot方法检测EGFR及其下游PI3K/Akt信号通路、细胞凋亡和细胞骨架调节通路分子的变化。结果表明，虫

6、体侵入能明显上调EGFR、PI3K、Akt、Bad、Bcl-2、MUC1、Caveolin和E-cadherin基因的表达，下调Bax和P53基因的表达，但不影响Paxillin和β-catenin基因I的表达。新孢子虫侵入可磷酸化EGFR(Tyr1173)、Akt（Ser473）和Bad（Ser112）。用EGFR抑制剂AG1478可减少新孢子虫对宿主细胞EGFR和Akt的磷酸化。且PI3K抑制剂LY294002可减少新孢子虫对Akt和Bad的磷酸化。综上表明，新孢子虫速殖子侵入可激活宿主细胞EGFR信号通路。抑制EGFR信号通路分子对新孢

7、子虫侵入宿主细胞的影响分别用EGFR信号通路分子抑制剂（EGFR抑制剂AG1478、PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂IV）处理293T细胞，速殖子感染后观察虫体感染细胞数量和细胞内虫体数量。结果表明，在24hAG1478和IV处理组感染细胞数量和细胞内虫体数量明显减少。而LY294002处理组与对照组相比无明显变化。表明宿主细胞EGFR信号通路的活化与新孢子虫速殖子的侵入有关。关键词：新孢子虫，体外培养，侵入，宿主细胞，EGFR信号通路IIAbstractRegulationofhostcellsEGFRsignalingpath

8、wayduringtheprocessofN.caninuminvasionNeosporosisisaprotozoosiscausedbyNeosporacan