微小隐孢子虫刺激对宿主细胞tlrs的影响

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1、微小隐孢子虫刺激对宿主细胞TLRs的影响TheeffectofTLRsofhostcellsafterCryptosporidiumparvumstimulation作者姓名：余裕强专业名称：预防兽医学指导教师：张西臣教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年06月06日本研究得到“国家重点基础研究发展计划（973计划）”（编号：2015CB150300）和吉林省长白山学者资助Thisstudywassupportedbythe‘NationalKeyBasicResearchProgram(973Program)ofChina’(Gra

2、ntNo.2015CB150300)andChangbaiMountainscholarsofJilinProvince中文摘要微小隐孢子虫刺激对宿主细胞TLRs的影响微小隐孢子虫是一种常见的顶复门原虫，常寄生在肠道上皮细胞中，可通过污染水源而造成隐孢子虫病的爆发，同时，微小隐孢子虫的感染也是器官移植、艾滋病患者等处于免疫抑制状态病人的致死因素之一。目前，市场上尚未有有效的防治隐孢子虫病的药物和疫苗，微小隐孢子虫感染宿主细胞后，宿主细胞的抗感染机制中诸多细节也还不清楚。为探索隐孢子虫病的有效防控手段，阐明宿主-病原相互作用机制显得尤为重要

3、。研究表明，宿主细胞Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）在对寄生虫的识别和相互作用中起着关键作用，宿主细胞在寄生虫刺激后，激活对应的TLRs和下游NF-κB信号通路，并使相应的细胞因子分泌量增加。然而，作为一种主要寄生在肠道，主要感染小肠上皮细胞的寄生性原虫，人小肠上皮细胞TLRs对微小隐孢子虫的识别机制却未见报道，微小隐孢子虫感染体外培养的小鼠细胞后TLRs的表达情况也不清楚。本研究旨在研究当感染了微小隐孢子虫后，宿主细胞TLRs对微小隐孢子虫的识别情况。微小隐孢子虫刺激Caco-2和RAW264.7细胞TL

4、Rs激活情况。在微小隐孢子虫子孢子刺激细胞2h后荧光定量PCR检测TLRs的表达情况，2h后Westernblot检测NF-κB激活情况，12h后ELISA检测TNF-α的分泌情况。试验结果表明当Caco-2细胞感染了微小隐孢子虫后，TLR2和TLR4得到显著的激活并引起下游NF-κB信号通路的激活和TNF-α的分泌，而当RAW264.7细胞感染了微小隐孢子虫后，检测到TLR2、TLR4、TLR11和TLR12的激活以及下游NF-κB信号通路的激活和TNF-α的分泌。微小隐孢子虫分泌性抗原刺激RAW264.7细胞TLRs的激活情况。为探明

5、能引起TLR11和TLR12激活的分子是否来自于分泌性抗原，分别采用微小隐孢子虫子孢子超声裂解抗原以及分泌性抗原刺激RAW264.7细胞，检测TLRs的表达情况、NF-κB激活情况以及TNF-α的分泌情况。试验结果显示，微小隐孢子虫子孢子超声裂解抗原能够引起TLR2、TLR4、TLR11和TLR12的激活，而分泌性抗原仅能引起TLR11的激活，微小隐孢子虫子孢子超声裂解抗原以及分泌性抗原刺激RAW264.7细胞后均能引起NF-κB激活以及TNF-α的分泌。由此确定I微小隐孢子虫子孢子分泌性抗原中确实存在着能激活TLR11的成分，能够激活T

6、LR12的成分则不存在于分泌性抗原中而是存在于微小隐孢子虫子孢子超声裂解抗原中。弓形虫分泌性抗原中能够激活TLR11和TLR12的分子是弓形虫profilin蛋白，通过对已完成的微小隐孢子虫基因组的查询，发现微小隐孢子虫也存在着profilin蛋白且其与弓形虫profilin蛋白具有较高的同源性（63%），微小隐孢子虫profilin（CpProfilin）也是一种分泌性抗原分子。CpProfilin刺激RAW264.7细胞TLRs的表达情况。为进一步验证微小隐孢子虫分泌性抗原profilin蛋白能够激活TLR11而不引起TLR12的激活

7、，本研究通过构建CpProfilin原核表达体系，表达并纯化CpProfilin蛋白，在CpProfilin刺激RAW264.7细胞后检测TLRs的表达情况、NF-κB激活情况以及TNF-α的分泌情况。此外，构建转染了TLR11的HEK293T细胞，在CpProfilin刺激细胞后检测IL-12的分泌情况。试验结果显示，CpProfilin能够激活TLR11而不激活其他TLRs，能够引起NF-κB信号转导通路的激活以及TNF-α的分泌量增加，CpProfilin刺激转染了TLR11的HEK293T细胞后检测到IL-12的表达量上调。综上所

8、述，Caco-2细胞TLR2和TLR4参与了对微小隐孢子虫的识别；RAW264.7细胞TLR2、TLR4、TLR11和TLR12参与了对微小隐孢子虫的识别；微小隐孢子虫分泌性抗原中的CpPro