奶牛源隐孢子虫的鉴定及隐孢子虫囊壁蛋白基因的克隆

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1、安徽农业大学硕士学位论文奶牛源隐孢子虫的鉴定及隐孢子虫囊壁蛋白基因的克隆姓名：孙涛申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李培英；张丹俊201205摘要隐孢子虫病(Cryptosporidisis)是由隐孢子虫f1C仰fD印Dr泐材圳感染引起的一种全球性人畜共患寄生虫病。隐孢子虫是人和动物腹泻的重要病原之一，也是人类艾滋病患者的主要致死因素之一。近年来，国内外学者对隐孢子虫病进行了较广泛而深入的研究，但合肥地区隐孢子虫种类尚不清楚。本课题旨在通过对合肥地区某奶牛场奶牛粪样中隐孢子虫的检查，获取隐孢子虫感染阳性奶牛，从阳性奶牛粪样中分离出隐孢子虫卵囊，采用形态学

2、和分子生物学方法进行隐孢子虫虫种鉴定，为隐孢子虫病的防治提供理论依据；提取隐孢子虫卵囊的总RNA，进行反转录获得隐孢子虫cDNA，扩增隐孢子虫囊壁蛋白基因，以期为筛选研制隐孢子虫疫苗的抗原候选分子提供资料。首先采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对合肥地区某奶牛场285头成年母牛粪样进行隐孢子虫卵囊检测，饱和蔗糖溶液漂浮法检出隐孢子虫阳性奶牛5头，其感染率为1．8％；改良抗酸染色法检出隐孢子虫阳性奶牛6头，感染率为2．1％。根据隐孢子虫卵囊的形态、大小和卵形指数(长／宽)等特征对所获虫体进行形态学鉴定，饱和蔗糖溶液漂浮法检获的卵囊为椭圆形或卵圆形，大小平均为7．

3、37um×6．13岬，卵形指数为1．20；改良抗酸染色法检获的卵囊为椭圆形或卵圆形，呈玫瑰红色，周围深染，中央淡染，大小平均为7．58肛m×6．20¨m，卵形指数为1．22，初步鉴定饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检出的隐孢子虫均为安氏隐孢子虫(cryptosporiditlmnndersoni)o其次采集饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测均为隐孢子虫阳性的5头奶牛粪样，分离隐孢子虫卵囊。根据隐孢子虫18srIⅢA基因和HsP70基因序列分别设计2对PCR反应引物和2对巢式PCR反应引物，以所获卵囊基因组为模板分别进行PCR反应和巢式PCR反应，对巢式PCR

4、反应的产物进行胶回收、克隆和测序，将测序结果与隐孢子虫有效虫种的18SrIⅢA基因和HSP70基因序列进行同源性分析和进化树构建，从而确定所获隐孢子虫的种类。结果显示PCR扩增出的隐孢予虫18SrRNA基因和HSP70基因片段分别为540bp和448bp，巢式PCR扩增出的隐孢子虫18SrIⅢA基因和HSP70基因片段分别为250bp和325bp(GenBank登录号分别为JQ031803、JQ031804、JQ031805、JQ031806、JQ031807、JQ031808、JQ031809、JQ031810、JQ0318ll、JQ031812)，与预期片段大

5、小基本一致；将巢式PCR产物序列与隐孢子虫相关序列进行同源性分析发现，这5株分离株18srRNA基因与安氏隐孢子虫仰fo印Drf旃”ma船如坶D”砂DQ989573序列一致性最高，两者在系统进化树上为同一分支；这5株分离株的HSP70基因片段与安氏隐孢子虫AY954892和D0989576序列一致性最高，且在系统进化树上为同一分支，因此确定所分离的5株奶牛源隐孢子虫分离株均为安氏隐孢子虫作乃矽幻．驴D，汹甜聊口玎沈坶D”f)。最后采集安氏隐孢子虫阳性奶牛的新鲜粪样，提取隐孢子虫总RNA，反转录得到cDNA，以单链cDNA为模板扩增出安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因部分片段

6、，并进行克隆、测序，将测序所得序列与GeneBank已发布的隐孢子虫囊壁蛋白基因序列进行序列比对，从而确定隐孢子虫囊壁蛋白基因的突变情况。通过反转录和PCR方法扩增出安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因499bp片段，经克隆、测序及序列分析，此次扩增出的CoWP序列与登陆号为D0989570的囊壁蛋白序列同源性为100％。综上所述，本研究获得了合肥奶牛隐孢子虫分离株及其18SrRNA和HsP70基因片段，为中国隐孢子虫病的临床诊断、分子生物学检测及虫种鉴定提供了依据；扩增出的奶牛源安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因，为今后隐孢子虫疫苗的研制奠定了基础。关键词：隐孢子虫，虫种鉴定，囊壁蛋

7、白，奶牛AbstractC拶ptosporidiosisisaglobalzoonoticparasiticdiseasecausedby(功幻印D，．￡击甜所，、^，hichcaninf．ectedpeopleandanimals．(功fD置pDr死矗h，"isoneoftheimportantpathogenfordia—1eainhumansandanimals．ItisalsooneoftIlemaincauseofdeatllofthehumanAIDSpatients．Inrecentyears，dispitescholarshaVeamoreexte

8、nsiVe