三种虫媒病毒一步法荧光定量rt-pcr检测技术的建立

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1、分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：2012648硕士学位论文三种虫媒病毒一步法荧光定量RT-PCR检测技术的建立EstablishmentofOneStepReal-timeRT-PCRforDetectionofThreeArboviruses作者姓名：千莎莎学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：分子病毒学指导教师：涂长春研究员郭焕成副研究员所在学院：动物科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢

2、所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文

3、的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要虫媒病毒（Arbovirus）是一类以吸血昆虫为传播媒介的病毒，通过吸血昆虫叮咬人、家畜及野生动物而传播疾

4、病，具有自然疫源性。该类病毒能引起烈性的人兽共患病，导致大量人畜患病或死亡，造成巨大经济损失的同时也严重威胁公共卫生安全。病原生态学及流行病学研究数据显示，我国目前存在为数众多的虫媒病毒，为有效开展虫媒病毒病的侦检，进而在我国防控该类疫病的发生和流行，建立早期的快速、敏感、特异的实验室检测方法至关重要。与人类疾病关系密切的虫媒病毒主要集中于披膜病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科和呼肠孤病毒科的某些成员。本研究通过对披膜病毒科的委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelanequineencephalitisvirus，VEEV）nsp1基因、

5、黄病毒科的蜱传脑炎病毒（Tick-borneencephalitisvirus，TBEV）NS1基因、布尼亚病毒科的新疆出血热病毒（XinjianghemorrhagicfeverVirus，XHFV）S基因序列进行保守性分析，各设计出一套能分别检测这三种病毒所有亚型的特异性PCR引物和Taqman探针。以体外转录制备的RNA为模板，通过反应体系和条件优化，分别建立了检测这三种虫媒病毒的一步法荧光定量RT-PCR方法，三种方法的扩增效率分别为：VEEV98.1%、TBEV98.4%、XHFV100%。对体外转录的RNA模板检测表明：

6、VEEV荧光定量RT-PCR方法的检测灵敏度达到3.27×102拷贝/μl，TBEV检测灵敏度达到5.82×102拷贝/μl，XHFV检测灵敏度达到9.80×102拷贝/μl。与针对上述病毒的普通PCR方法相比，本研究中三种方法的检测灵敏度高于已报道的现有方法或与之相当。特异性实验结果显示，三种方法均具有良好的特异性，与引起相似症状或与目标病毒同源性较高的同属病毒不产生非特异性扩增。本研究建立的上述检测方法为相关疫病的流行病学调查、监测和快速诊断提供了有效的技术手段。关键词：委内瑞拉马脑炎病毒，蜱传脑炎病毒，新疆出血热病毒，一步法荧

7、光定量RT-PCR，检测IAbatractArboviruses,asimportantcausativeagentsofnaturalfocaldisease,areagroupofvirusestransmittedbyhematophagousinsectsandresponsibleformanyseverezoonosesofhumans,livestocksandwildanimals,resultinginmanydeathesandhugeeconomicloss,soarbovirus-relateddisease

8、sarebigthreatstopublichealthandsafety.Previousinvestigationofpathogenecologyandepidemiologyshowedthatarbovirusispreva