lmov cp原核表达、抗血清制备及叶绿体中的检测

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1、乂連綠＾大葦ＤＡＬＩＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ破±享恆巧交ＭＡＳＴＥ艮ＡＬＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＬＭｏＶＣＰ原核表达、抗血清制备及叶绿体中的检测生物学学科专业Ｊ？作者姓名Ａ徐品Ｓ副教授＿＿＿＿＿＿指导教师＿＿２０１６年６月７日答辩日期ｆ—＇■＇亡＇Ｗ电古二硕±学位论文ＬＭｏＶＣＰ原核表达、抗血清制备及叶绿体中的检测ＰｒｏｋａｒｏｔｉｃＥｘｒｅｓｓｉｏｎＡｎｔｉｓｅｒｕｍＰｒｅａｒａｔｉｏｎａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎ

2、ｙｐ，ｐＣｈｌｏｒｏｌａｓｔｓｏｆＬＭｏＶＣＰｐ作者姓名：来炯学科、专业：生物学学号：２１３１８０９３指导教师：徐品＾副教授２０１６年５月完成日期：乂么巧义乂緣ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中己经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果一。与我同工作的同

3、志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：ＬＭｏＶＣＰ原核煮达、抗血清制备及叶绿体中的检测。《＇作者签名：斬巧日期：加年月曰＿大连理工大学硕±学位论文摘要百合斑驳病毒（ｊＬ曲ＯＴｏＷｅＬＭｏＶ）属于马铃墓Ｙ病毒属，是一ＬＭｏＶ侵染百合的主要病毒之。侵染百合后引起斑驳或条纹症状，严重时导致百合种球产量和质量降低。目前，，关于ＬＭｏＶ的致病机理尚不清楚其编码蛋白功能的研究也尚属空白，严重阻碍了百合病毒病的防治工作。本文建立了检测Ｌ

4、ＭｏＶ的血清学方法，并初步证明了ＬＭｏＶ对百合叶绿体的影响，期为阐明ＬＭｏＶ的致病机理奠定基础。ｅｎＢａ－根据Ｇｎｋ中ＬＭｏＶ基因序列（ＨＭ２２２５２１．１），设汁特异性引物，利用ＲＴＰＣＲ技术，Ｗ提取的百合叶片总ＲＮＡ为模板，扩增到ＬＭｏＶＣｆ基因，获得了约８２２ｂｐ的ＴＭ？ＭＤ－ＭＤ－目的片段。将目的片段连接到克隆载体Ｐｉ８Ｔ中，构建重组质粒ｐ１８Ｃ尸，将其转化至大肠杆菌ＤＨ５ａ中，提取重组质粒进行ＰＣ民和双酶切验证正确后测序，结？ＭＤｌ８－Ｃｆ果表明成功构建了重组质粒ｐ。？ＭＤ－ＰＣ民ＭｏＶ－ｐｉ８心为模板，

5、扩增得到ＬＣ尸基因。利用ｐＥＴ２８ａ巧作为表达－载体，ＥＴ２８ａＣＰ，将其转化至大肠杆菌ＢＬ２１ＤＥ３中，用ＰＴＧ成功构建了重组表达质粒ｐ（）Ｉ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＥＴ２诱导表达，结果发现８ａＣｆ成功在大肠杆菌中表达出相对，经过ｐ分子质量约为３４ｋＤａ的带有曲Ｓ标签的融合蛋白。对诱导表达的温度和时间进行优化，’确定了蘭合蛋白的最佳表达条件是３０Ｃ条件下诱导４ｈ。一－－利用ＮｉＩＤＡＳｅｆｉｎｏｓｅ在变性条件下对表达产物进行纯化，得到表达量较高的单目的蛋白条带。表达的顧合蛋白为抗原制备ＬＭｏＶ的抗血清，利用间接ＥＬＩＳＡ

6、和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分别对制备的抗血清进行了检测，其效价为１：５１２００，且特异性较高。随机一７个ＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ检选取百合样品同时进行间接化测，两次检测结果致，由此证明，本研究中制备的ＬＭｏＶＣＰ抗血清可用于百合样品的检测。电镜观察发现：感病百合叶绿体膨胀变形，基质片层散乱，叶绿体内淀粉粒肿大，从而证明ＬＭｏＶ侵染破坏叶绿体结构。免疫金标记电镜观察显示，与ＬＭｏＶＣＰ抗原特－ＰＡＧＥＷ异性结合的胶体金颗粒主要定位于类囊体膜上。ＳＤＳ和ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证明ＬＭｏＶ一，致侵染百合后ＣＰ存在于叶绿体内，这

7、与免疫金标记的观察结果。在离体条件下进行ＬＭｏＶＣＰ的叶绿体跨膜运输实验，研究赔育时间和ＣＰ蛋白浓度对ＬＭｏＶＣＰ在百合叶绿体中离体跨膜运输效率的影响。结果显示在离体条件下ＬＭｏＶＣＰ蛋白浓度为３０腿４ｉＬ时’与叶绿体保湿１ｍｉｎ即可进入叶绿体中。关键词：百合斑驳病毒；外壳蛋白基因；原核表达；抗血清制备；叶绿体－－ＩＬＭｏＶＣＰ原核表达、抗血清制备及叶绿体中的检汲ｊＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｒｅｓｓｉｏｎＡｎｔｉｓｅｒｕｍＰｒｅｒａｔｉｏｎａｎｄＤｅｂｃｔｉｏｎｉｎｐ，ｐａＣｈｌｏｒｏｐｌａ

8、ｓｔｓｏｆＬＭｏＶＣＰＡｂｓｔｒａｃｔｖｚｎ＂（ＬＭｏＶ）ｉｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏ化ｙ，ｗｈｉｃｈ