应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒ns2蛋白相互作用的宿主蛋白

《应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒ns2蛋白相互作用的宿主蛋白》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒NS2蛋白相互作用的宿主蛋白IdentificationofinteractingproteinofinfluenzavirusNS2byyeasttwo-hybridsystem邵信媛指导教师姓名李克生研究员（甘肃农业大学兰州730070）胡永浩教授（甘肃农业大学兰州730070）李呈军研究员（中国农业科学院哈尔滨150001）学科专业名称预防兽医学研究方向动物传染病学及病原分子生物学论文答辩日期2015年5月30日学位授予日期20

2、15年6月答辩委员会主席罗建勋研究员评阅人冉多良教授马忠仁教授2015年6月ClassificationNo.：Secrecylevel：UDC：Schoolcode：10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeIdentificationofinteractingproteinofinfluenzavirusNS2byyeasttwo-hybridsystemPostgraduate:ShaoXinyuanAdvisor:LiKeshe

3、ngHuYonghaoLiChengjunSpeciality:PreventiveVeterinaryScienceResearchField:AnimalInfectiousDiseasesandPathogenMolecularBiologySubmittedTime:June2015Address:Lanzhou,China,730甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要摘要流感病毒的NS2蛋白能介导病毒核糖核蛋白复合体(vRNP)的核输出过程，并且能够调控病毒聚合酶的活性，参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程

4、。但相对于流感病毒其余蛋白质来讲，NS2的研究鲜有报道。经过本研究捕获到新的与流感病毒NS2相互作用的宿主蛋白，不但拓展了流感病毒与宿主因子的相互作用网络，而且为进一步探索流感病毒的复制周期和致病及免疫机制奠定了基础。酵母双杂交系统作为蛋白质相互作用的经典技术，已被应用于宿主蛋白与流感病毒蛋白的相互作用研究。本试验采用该技术为基础，以H5N1流感病毒的NS2蛋白作为“诱饵”蛋白，从含有Calu-3、A549、THP-1和U251四种细胞的混合cDNA文库中挑选出其相互作用蛋白，研究互作的生物学功能。主要研究内容如下：(1)

5、以禽流感病毒A/Anhui/02/2005(H5N1)NS2蛋白为诱饵，从含有Calu-3、A549、THP-1和U251四种细胞的混合cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白将H5NS2克隆于pGBKT7中，转化酵母菌Y2HGold，检测诱饵质粒无细胞毒性以及不存在自激活现象后，将pGBKT7-H5NS2/Y2HGold与4种细胞系的Y187cDNA文库进行杂交，经过筛选最后共捕获到7种蛋白，分别为HGS、EXOSC4、ZWINT、PRDX3、IRF3、NDUFB9和RMND5B。根据GeneOntology分析结果，这些蛋

6、白分别参与细胞生长发育、细胞代谢和细胞定位等过程。(2)免疫共沉淀(Co-IP)验证其相互作用在实践中选择了7种蛋白中的过氧化物氧还酶3(PRDX3)进行了更为深入的研究。将H5NS2、PRDX3分别克隆于pEGFP-C1、pCAGGS中，在293T细胞中共转染pEGFP-C1和pCAGGS-myc-PRDX3或pEGFP-C1-H5NS2和pCAGGS-myc-PRDX3质粒，进行Co-IP及Westernblot检测。结果显示在293T细胞中，外源表达的H5NS2蛋白和PRDX3蛋白拥有特异性的相互作用。(3)GSTp

7、ull-down进一步验证其相互作用将H5NS2克隆于pGEX-6p-1中，并在大肠杆菌中表达制备GST-H5NS2重组蛋白和GST标签蛋白。以GST-H5NS2融合表达蛋白为诱饵或者作对照的GST蛋白与转染pCAGGS-myc-PRDX3质粒的293T细胞的细胞裂解液孵育，进行GSTI甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要pull-down。通过GSTpull-down试验结果显示，H5NS2蛋白与PRDX3存在特异的，直接的相互作用。为进一步研究两者之间相互作用如何影响NS2蛋白功能以及病毒的复制周期奠定了基础。关键词

8、：禽流感病毒；NS2蛋白；酵母双杂交；免疫共沉淀；GSTpull-downII甘肃农业大学2015届硕士学位论文SummarySummaryTheNS2proteinofinfluenzavirusmediatesthenuclearexportprocessofviralribonucleoprote