利用酵母双杂交系统筛选与猪calsarcin-1基因相互作用的蛋白

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1、利用酵母双杂交系统筛选与猪的Calsarcin．，基冈的相互作用蛋白中文摘要Calsarcin(Calcineurin．associatedsarcomericprotein)基因家族是一个与钙调神经磷酸酶(Calcineurin)结合的肌肉特异蛋白质新家族，已发现的Calsarcin基因家族成员有Calsarcin—j、Calsarcin．2和Calsarcin一3。其中，Calsarcin—J『基因在心肌和骨骼肌慢肌纤维中特异表达，Calsarcin一2和Calsarcin一3只在骨骼肌的快肌纤维中特异表达

2、。研究证实，Calsarcin一7基因敲除小鼠的肌肉过度生长，Calcineurin活性升高，表明Calsarcin—J『抑$1JCalcineurin的活性。因此，Calsarcin一』基因可能通过与Calcineurin结合调节Calcineurin的活性，共同参与肌细胞内由Ca2+调控的信息传递功能，从而调控其它相关基因的表达，在肌纤维的分化和发育过程中发挥重要的作用。另外，Calsarcin—j与a-actinin、y-filamin、telethonin等多种结构蛋白质共定位于Z．disc。因此，推澳

3、lJCalsarcin—J对Z．disc结构的形成和稳定起重要作用。为了更好的认识Calsarcin．J基因及其互作蛋白对肌细胞钙离子的调控作用，了解快慢肌纤维的决定和分化的分子机理，本研究采用酵母双杂交筛选技术对Calsarcin—J相互作用蛋白质进行了筛选并对其功能进行了初步研究。主要研究成果如下：1．从pEGFP．N1一CSl荧光表达载体中分离得至lJCalsarcin—J『的编码区，并构建到pGBKT7诱饵表达载体中，获得了能成功表达且无毒性的pGBKT7一CSl诱饵表达载体。2．成功地分离、纯化了猪肌

4、肉组织的双链cDNA，用来表达猎物文库的融合蛋白。3．将诱饵载体、双链cDNA及猎物载体pGADT7．Rec共转化到感受态的酵母细胞中，进行酵母双杂交筛选，初步筛选到与Calsarcin—J相互作用的29个阳性克隆。4．经PcR筛选、酶切、测序和结果分析，获得到3个感兴趣的蛋白(C4．蹭，、TNNT3和ACTN3)。其casQJ『和TNNT3参与了肌细胞中对钙离子的调控，ACTN3则参与了维持Z线结构稳定。关键词：Calsarcin；钙调神经磷酸酶；猪；肌肉；z盘；酵母双杂交华中农业大学硕士学位论文ABSTRA

5、CTCalsarcinsarecalmodulindependent，calcium-activatedproteinphosphatasethatplaysanimportantroleintransducingcalcium-dependentsignalsinavarietyofcelltypes．Theycompriseanovelfamilyofmuscle·-specificcalcineurin··interactingproteinsandplayallimportantroleinmodula

6、tingboththefunctionandsubstratespecificityofcalcineurininmusclecells．Theexpressionofcalsarcin一1isrestrictedtoslow-twitchskeletalmusclefibres，whereasmatofbothcalsarcin一2andcalsarcin一3isenrichedinfast—twitchfibres．Calsarcin一1knockoutmiceshowenhancedcalcineurin

7、activityandanexcessofskeletalmusclefibres，indicatingthatcalsarcin一1negativelymodulatestheactivationofcalcineurin．Thecalsarcinsmayalsoplayanimportantroleinmyofibrillardifferentiationanddevelopmentviatheirabilitytoregulateotherrelatedgeneexpress，aswellasapossi

8、bleinvolvementincalciumionsignaltransductionpathways．ThecolocalizationwithseveralkeyZ—discproteinssuchas0【-actinin、Y-filaminandtelethoninsuggeststhatcalsarcinsservetocross-linktheseproteins，ther