酵母双杂交系统筛选iex_1相互作用蛋白的研究

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1、酵母双杂交系统筛选IEX_1相互作用蛋白的研究分类号UDC密级编号中南大学CENTRALSOUTHUNIVERSITY七年制硕士学位论文论文题目:酵母双杂交系统筛选IEX一1相互作用蛋白的研究学科、专业:研究生姓名:导师姓名及其专业技术职称:外科学(骨科)柳文清肖涛教授中南大学二零一零年五月分类号UDC编t」万硕士学位论文酵母双杂交系统筛选IEX一1相互作用蛋白的研究ThestudyofIEX一1interactionProteinusingyeast俪。-hybridsystem作者姓名:柳文清学科专业:外科学(骨科)学院(系、所):湘雅二医院指导教师:肖涛教授论文答辩日期迎恻嗯自答辩

2、委员会主席中南大学二零一零年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签“;.~裤城日期:业牡月血关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文;学校可根据国家或湖南省有

3、关部门规定送交学位论文。作者黯娜瑰导师签拯。期:业年少蛋硕士学位论文中文摘要摘要【目的】通过酵母双杂交技术筛选成人肝cDNA文库，寻找IEX一l相互作用蛋白，为进一步深入功能机制研究奠定基础。【材料与方法】应用酵母双杂交技术，通过筛选成人肝。DNA文库，寻找IEX一1相互作用蛋白。用Tri201方法提取骨肉瘤MG一63细胞朋A，RT一PCR扩增刃，匕1基因编码区，电泳回收SPe咖otl双酶切连入pDBLeu载体，构建表达质粒。进一步进行，诱饵蛋白的自激活检测，文库筛选和回转验证等实验获得真阳性克隆。提取真阳性的克隆中cDNA融合质粒，测序，进一步生物信息分析。【结果】1.在融合蛋白表达质

4、粒的构建过程中，我们成功获得IEX一1基因编码区片段并构建出融合蛋白表达质粒pDBLeu一IEx一1，经过酶切鉴定后测序证实各诱饵载体均切出了正常长度的插入片段和载体骨架片段。2.将重组成功的pDBLeu一IEX一1和空载体pDBLeu转化入酵母菌AH109进行毒性及自激活检测，结果发现pDBLeu一IEx一1对酵母菌AH109无毒性作用及自激活作用。3.使用诱饵质粒pDBLeu一IEX一1转化感受态细胞，30℃培养3一sd后，将菌液涂布于sD/一Trp八Le‘一压s/一Ade平板上初步筛硕士学位论文中文摘要选阳性克隆，初筛的阳性克隆进行X一a一gal显色进一步确认，结果共筛选出12个阳

5、性克隆。4.提取12个克隆中cDNA融合质粒，与pDBLeu一IEX一1共转化入酵母菌株AH109回转验证，结果表明其中4个克隆为真阳性克隆，其他为假阳性克隆。将这4个真阳性克隆扩大培养、提质粒后测序，查出该cDNA融合质粒对应的基因，最终确定四个IEX一l相互作用的蛋白:Creaetiveprotein(e即)、Clusterin(CLU)、CathePsinB(CTSB)、HeatshoekProtein105(HSPHI)。[结论1:1.成功构建酵母双杂交系统，经检验能够进行进一步的IEX一1相互作用的蛋白的筛选;2.通过酵母双杂交系统筛选出四个IEX一1相互作用的蛋白:Creae

6、tiveProtein(C即)、Clusterin(CLU)、CathePsinB(CTSB)、Heatshockprotein105(HSpHI)。为进一步深入骨肉瘤发病机制研究奠定基础。关键词:基因;克隆;IEX一1;酵母双杂交;骨肉瘤细胞;蛋白相互作用硕士学位论文英文摘要ABSTRACTOBJECTIVE:ByscreeningofadultlivereDNAlibral了useyeasttwo一hybridtolookforIEX一1inieractionProteinandPrePareforthefurtherstu勿ofitsfunetionalmeehanism.MATE

7、RIALSANDMETHODS:LookforIEX一1interaetionProteinthroughthesereeningofadultlivereDNAlibraryusingyeasttwo一h沙ridteehnology.ExtraetedRNAfromosteosareomaMG一63eellsthroughTrizolmethod.RI’-PCRamPlifiedIEX一1geneeodingregion，then