酵母双杂交法筛选和bace蛋白有相互作用蛋白

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1、摘要0一淀粉样前体蛋白APP(p—amyloidprecursorprotein)水解产生的B一淀粉样蛋白(p—amyloidpeptides，AB)在阿尔茨海默氏症(hlzheimerDisease，AD)的发病机理中起着重要的作用，BACE(B—siteAPP—cleavingenzyme)被认为是AB形成的关键酶，已经成为近年来阿尔茨海默氏症研究及筛选药物靶的热点之一。为了更好的认识和理解BACE在阿尔茨海默氏症病理过程中的作用机制，我们利用酵母双杂交法筛选与之有相互作用的蛋白。用BACE作为诱饵蛋白筛选人胎脑文

2、库后，得到65个阳性克隆。经测序和序列比对，我们选择三个蛋白进行深入研究：分别为flotillin蛋白、毒蕈碱受体CHRMl蛋白(cholinergicreceptormuscarinic1)及乙酰胆碱酯酶膜锚定蛋白(acetylcholinesteraseputativemembraneanchor)。13一半乳糖苷酶活性测定说明这三个蛋白在酵母AHl09中可以与BACE发生相互作用。我们还构建了可以在哺乳动物细胞中表达的这三个蛋白的质粒，为进一步验证它们是否能在哺乳动物细胞中发生相互作用做好了准备。我们的实验首次发

3、现了flotillin蛋白、CHRMl以及乙酰胆碱酯酶膜锚定蛋白都能与BACE发生直接相互作用，为进一步研究BACE的定位、在AD病理作用中的信号传导途径及作用机制提供了依据。关键词：酵母双杂交；BACE：ADAbstractThe13-amyloidpeptides(A13)derivedfromproteolyticcleavageoftheamyloidprecursorprotein(APP)playamajorroleinthepathogenesisofAlzheimer’sdisease(AD)byfor

4、mingaggregated，fibrillarycomplexesthathavebeenshowntobeneurotoxic．The3-siteAPPcleavingenzyme(BACE)hasbeenidentifiedasakeyenzymeleadingto3-amyloidfomaation．TofurtherunderstandthefunctionandmechanismofBACEinthepathologyofAD，weutilizedBACEasthebaittoscreenfetalbrai

5、neDNAlibraryusingtheyeasttwo—hybridsystem．Fromthe65poskiveclonesob协ined，wechoseflotillin，cholinergiereceptormuscariniel(CHRMl)andaeetylcholinesteraseputativemembraneanchorforfurtherresearch．The3-galactosidaseactivityassaydemonstratedthatflotillin，CHRMlandacetylc

6、holinesteraseputativemembraneanchorcaninteractwithBACEinyeaststrainAHl09．WealsoconstructedplasmidsthatcanexpressthethreeproteinsindividiallyinmammaliancellstoconfirmtheirputativeinteractionswithBACE．OurresultsfirstdemonstratedthatBACEcaninteractwiththesethinepro

7、teinsinyeaststrainAHl09．Ourresultmaycontributetofurtherunderstandingoflocalization，signaltransduetionandmechanismofBACEinADKeyword：YeastTwoHybrid；BACE；AD厦门大学学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。学位论文作者签名：

8、lt、羲孰}日期：2006年4月21日。声明人(签名)：阀乏研l印∥年7月z／日厦门大学学位论文著作权使用声明本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据