酵母双杂交系统筛选ctcf相互作用蛋白

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1、四川大学硕士学位论文作者杨博导师覃扬教授中文摘要酵母双杂交系统筛选CTCF相互作用蛋白生物化学与分子生物学争业研究生杨博指导教师覃扬教授背景和目的基因组印记(Genomicimprinting)是一种配子发生过程中对某些基因不同亲本来源的等位基因进行差别标记的现象，研究表明基因印记表达异常是某些恶性肿瘤重要的分子生物学特征，印记的改变可能是肿瘤发生中的重要环节。CTCF(ccctcbindingfactor)是基因组印记调控中发挥重要作用的一类蛋白质，编码CTCF的基因定位于16q22，是一类在哺乳

2、动物中广泛表达的高度保守的核蛋白，它可以和启动子，激素反应性基因沉默子，隔离子以及基因组印记相关元件等结合，在基因后成修饰，细胞生长和x染色体沉默等过程中有广泛作用。CTCF因其在肿瘤中常常发生功能缺失而被认为是一种候选抑癌基因。CTCF作为一个有如此丰富功能的蛋白质，不难让人联想到其是一个复杂的核酸蛋白质相互作用体系中重要的一环，如此多样的功能的完成也决不是独立进行的，其必然有众多的其他元件共同完成这些功能。本室前期研究亦发现人原发性肝癌IGF2基因印记异常，同时发现CTCF在其中具有重要作用，为

3、进一步探讨CTCF及其相互作用蛋白调控人肝IGF2基因印记的机理，以及探讨在人肝四川大学硕士学位论文作者杨博导师覃扬教授癌中恢复16F2基因的正常的可能途径，本课题采用酵母双杂交的方法筛选正常人肝组织中与CTCF有相互作用的蛋白质。方法CTCF具完整编码序列的eDNA克隆由美国纽约大学w．w．Quitschke教授惠赠，经对CTCF完整编码序列的旁侧多克隆位点的适当修改，使其与质粒载体pGBKT7连接重组为诱饵质粒pGBKT7／CTCF，保持了正确的读码椎架。通过检测转化诱饵质粒的酵母AHl09在S

4、D／-Trp，SD／一Ade／一Trp，SD／一His／一Trp，SD／一Leu／一Trp固体培养基上的生长情况，判定是否有自激活发生，并鉴定了重组诱饵蛋白的毒性。以转化诱饵质粒的酵母Attl09菌株与人肝cDNA酵母文库进行杂交以筛选有相互作用的酵母克隆，同时进行了文库滴度测定和杂交效率测定。依次在三缺培养基上，四缺培养基上培养和筛选，以及用13一半乳糖苷酶印膜法检测阳性克隆内lacZ报告基因的表达，对双杂交杂合子进行验证和筛选，获阳性酵母克隆。然后提取阳性酵母克隆质粒，采用通用引物PCR扩增酵双

5、杂交阳性酵母克隆中与pGADT7同源重组的人肝cDNA片段，并采用HaelII限制性内切酶进行分类分析，将所有阳性克隆酵母质粒全部转化大肠杆菌Dtt5d，并提取质粒重复PCR及酶切分析，验证了阳性克隆的正确性，同时减少了克隆的重复。根据PCR及酶切分析结果在70个阳性克隆中选取六个阳性克隆进行测序。结果重组穿梭质粒pET-28a(+)／CTCF经EaoRI与NaoI酶切鉴定构建成功，CTCF读码框架正确。重组诱饵质粒pGBKT7／CTcF经BamHl和SalI双酶切及基因测序鉴定证实构建成功，CTC

6、F读码框架正确。诱饵蛋白实验证实无自激活作用，对酵母AHl09菌株无毒性。文库的滴度(5×107>2×107)及杂交效率(6％>2％)，符合要求，酵母双杂交后在三缺培养基上共筛选得到400个阳性克隆，在四缺培养基上继续培养这400个阳性克隆共筛选得到200个阳性克隆，13一半乳糖苷酶印膜法检测200个阳性克隆，筛选得到70个阳性克隆。PCR扩增阳性酵母克隆，结果均为阳性，2四川大学硕士学位论文作者杨博导师卓扬教授可见大小不等扩增片段，多介于250bp～2．Okb之间。结论通过各种筛选验证实验说明以C

7、TCF为诱饵蛋白的人肝eDNA酵母双杂交系统构建成功，并筛选获得了与CTCF相互作用的酵母阳性克隆及蛋白质编码基因。关键词：CTCF：酵母双杂交；人肝cDNA酵母文库3四川大学硕士学位论文作者杨博导师卓扬教授EnglishabstractSCREENINGINTERACTIoNPRoTEINoFCTCFBYYEASTTWoHYBRIDSYSTEMSpecialityBiochemistryandmolecularbiologyMastercandidateYang，BoSupervisorYang,

8、QinBaekgroundandObjectGenomicimprintingisanepigeneticmodificationmmegermlineleadingtopreferentialexpressoneofthetwoparentalalleles．Studieshaveshownevidencesthatgenomieimprintingplayallimportantroleincarcinogenesisandcouldberegardasmolec