酵母双杂交筛选pa28γ相互作用蛋白

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文酵母双杂交筛选PA28y相互作用蛋白IdentificationofproteinsinteractingwithPA28ybyyeasttwo—hybrid课题来源：国家863课题资助项目(NO：2006AA02A311)学位申请人覃世逆导师姓名徐伟文研究员专业名称免疫学培养类型统招培养层次硕士所在学院生物技术学院2013年3月30日广州／／III／I／Iz／／／／HI，／／I／I／。／I／H19l／H12／／I／I／9I／／／／19／／Ill／硕士学位论文酵母双杂交筛选PA28Y相互作用蛋白硕士研究生：覃世逆导师：徐伟文摘要研究背景及

2、目的：PA287(又称REGv、1lsv、PSME3)是一种蛋白酶体调节因子，它能结合到20S蛋白酶体的外环并促进小肽的降解，这个过程并不依赖蛋白的泛素化也不依赖ATP，这与PA700不同，后者是一种能识别并降解泛素化蛋白的大分子复合物。目前已经有证据证明，PA28y．20S蛋白酶体也能降解完整的蛋白分子，如HCV-core和SRC．3。这说明PA287．20S蛋白酶体能参与重要的细胞调节过程。PA287是PA28(包括PA28ct、eA28p、PA287)三种同系物中最保守的一种，而且它主要定位在细胞核中，这与其他两种同系物主要定位在细胞质中不同，这可以认为PA287与

3、其他两种同系物相比存在着不同的生理功能。目前对泛素一蛋白酶体通路的研究已较为深入并取得一些实质性进展，包括蛋白酶体抑制剂的药用研发和应用(如Velcade，雷公藤红素(Celastr01)等)，但对泛素非依赖性一蛋白酶体途径的认识还有待深入。值得关注的是最新研究发现，PA287也能够降解完整的内源性蛋白分子，是新发现的蛋白酶体降解蛋白的泛素一非依赖机制途径上的一个重要蛋白酶体因子。细胞诱导分裂实验、PA287基因敲除小鼠研究、以及RNAi干扰研究等均证实：PA287参与了细胞的转化和细胞周期的调控，PA287在有丝分裂细胞及快速增长细胞中高表达(包括在快速分裂的甲状腺癌细

4、胞中的高表达)，而knockdown或knockoutPA287可降低细胞的生长速度、阻止细胞周期进入S期。一些实验室在对肿瘤凋亡蛋白相互作用蛋白筛选时意外发现B．Raf,MEKK3、FLASH(CASP8．assosiatedprotein摘要2)、Daxx、RanBPM、PIASI等细胞凋亡相关因子均能与PA287相互作用。而Li研究组在研究乳腺癌细胞时首次发现并证明PA287能与癌基因SRC．3相互作用并在体内、体外降解这种完整的内源性蛋白(Cell，2006)。随后的研究又发现了几个重要的PA287作用靶蛋白，如细胞周期调控蛋白P21、P16、P19(Lietal

5、。，MolCell，2007；Chenetal。，MolCell，2007)，P53(Zhang，EMBO，2008)，G结合蛋白受体(NakahataN，2007)及泛素连接酶smurfl(FEBSLett，2010)等。有研究表明PA287可作为乳腺癌的潜在标志蛋白，它能促进乳腺癌细胞的生长(MedOncol，2011)。但研究发现小鼠和人不同组织的PA287的mRNA和蛋白水平不一致。最近的研究发现PA287参与了DNA损伤修复反应(cellcycle，2011)。这些最新的研究分析表明，PA28y与肿瘤的发生发展，尤其在凋亡机制和通路上，具有十分重要的生物学功能，

6、甚至有望成为肿瘤治疗的辅助药靶(增敏剂)(IMao，CellMolLifeSci，2008；2005)。鉴于PA287是一种核定位蛋白(这不同于其同系物PA28et、PA28p定位在胞浆)，但在细胞有丝分裂期却弥漫整个细胞，我们推测：PA28y的不同细胞定位对细胞不同时期有着不同的影响，与PA287对上述重要靶蛋白的精细调控密切相关。我们的前期研究初步验证了这一点：我们构建的胞浆定位表达截断体PA28yKL03．15和PA28yKL03．17与核定位表达截断体PA287KL03．3对HepG2和Chang细胞的生长起到了不同的作用(王穗海，硕士毕业论文，2008)。最新研

7、究证实，PA28y的过表达与直肠结肠癌、甲状腺癌和肝癌的发生发展密切相关。对92例原发性肺癌，48例结肠癌，49例甲状腺癌和206例肝癌样本进行免疫组化鉴定，发现高表达PA287的例数均超过50％。通过GEO数据库搜索和芯片验证平台选出与其相关基因，并验证了它可通过作用于p53、mcy通路等促进这些肿瘤的病理过程。肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞