酵母双杂交系统筛选人dnd1相互作用蛋白

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1、分类号学校代码10542密级学号201102191609酵母双杂交系统筛选人DND1相互作用蛋白ScreeningforProteinsInteractingwithhumanDND1byYeastTwo--HybridSystem研究生姓名塞垫盐指导教师姓名、职称堑：』：室塾撞学科专业生堡堂研究方向生殖生理湖南师范大学学位评定委员会办公室二。一四年四月摘要目的：本课题研究的目的是在正常人脑eDNA文库中通过酵母双杂交技术筛选与人DNDl相互作用的蛋白质，并对筛选出的蛋白质进行相关功能初步分析，为进一步研究

2、人DNDl的功能及信号通路奠定基础。方法：(1)以人dndleDNA为模板用PCR的方法扩增人dndl目的基因，目的片段和重组质粒行双酶切，连接，转化大肠杆菌，构建人DNDl蛋白的酵母双杂交诱饵质粒pDBleu—dndl，测序比对结果匹配后检验其毒性和自激活性，同时扩增正常人脑eDNA文库，为下一步进行DNDl蛋白的相互作用蛋白筛选及相互作用网络的构建奠定基础；(2)在正常人脑eDNA文库中，利用酵母双杂交技术筛选与人DNDl相互作用的蛋白，得到的阳性克隆质粒行双酶切及测序鉴定；(3)用共转化法将诱饵质粒p

3、DBleu—dndl和阳性克隆质粒回转入酵母菌AHl09中进一步验证；(4)回转验证阳性克隆质粒提取后行测序及同源性分析。结果：(1)构建了穿梭质粒pDBleu．dndl，并通过检测证实构建的重组质粒对酵母菌无毒性，无自激活性；(2)应用酵母双杂交技术以及生物信息学分析，我们在正常人脑组织的eDNA文库中筛选出四个与人DNDl有相互作用的蛋白质，分别为GRN，FLADl，EFEMPl，RNF31。通过酵母双杂交回转验证及NCBI数据库中blast分析，排除酵母蛋白干扰、实验结果假阴性、假阳性，比对DNA序列

4、100％匹配。结论：(1)成功构建用于酵母双杂交技术筛选的诱饵质粒pDBLeu—Dndl；(2)利用酵母双杂交技术我们成功的筛选出了与人DNDl蛋白相互作用的四个蛋白质，分别为(GRN，FLADl，EFEMPl，RNF31)。关键词：人DNDl蛋白；人脑cDNA文库；酵母双杂交系统；蛋白质相互作用；ⅡABSTRACTObjective：TheobjectiveofthisresearchistoscreenoutproteinsinteractionwithDND1fromhumanbraincDNAlib

5、raryapplyingwiththeyeasttwo-hybridtechnologyandtoanalyzethefunctionsofselectedproteins．ItmakesthebasisforfurtherunderstandingtheDndlbiologicalfunctionanditssignalpathway．Method：(1)AmplifyDND1targetfragmentusinghumandnd1cDNAasatemplatebyPCR．ThetargetDndlfra

6、gmentwasinsertedtothebaitvectorpDBLeutomaketheyeasttwo—hybridbaitplasmidpDBleu—dndl，andAndidentifytherecombinantplasmidbyrestrictionanalysisandsequencing，alsoexaminatethepDBleu—dndltoxicityandself-activating．ThusitprovidesfoundationforthenextsteptoscreenDN

7、D1interactingproteins；(2)Useyeasttwo—hybridscreeningtechnologytoselectproteinswhichinteractwithDND1innormalhumanbraincDNAlibrary，andpositiveclonesweredigestedandsequenced；(3)C0transformatethebaitplasmidpDBleu—dndlandpositivecloneplasmidsintotheyeastAHl09fo

8、rfurtherverification；(4)Afterrotaryverification，thepositivecloneplasmidsDNAweresequencedandanalysedbybioinformationtechniques．Result：(1)CounstructashuttleplasmidpDBleu—dndl，anditisconfirmedthattherecombinantp