酵母双杂交技术筛选鸭圆环病毒cap蛋白互作的宿主蛋白

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4、使用过的材料。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。ｖＴ月研究生签名：年乂百关于论文使用巧巧的声巧，本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定即：学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不、缩印或扫描等复制手段保存同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研巧生签名：年ｒ月乂Ｔ日导师签名；户乐年厂月日拜四川农业大学硕±学位论文中文摘要重要的结构蛋白，组成病毒的

5、衣壳鸭圆环病毒Ｃａｐ蛋白是病毒，在宿主免疫应答，中起着重要作用，为探究其与宿主蛋白之间的相互作用期了解该蛋白在病毒入侵机体过程中发挥的功能。本论文！鸭圆环病毒Ｃａ蛋白为诱巧，从感染鸭圆环病毒的ｐ一鸭赃脏的酵母双杂交ｃＤＮＡ文库中筛选与其有相作的宿主蛋白质，为进步研究其在入侵宿主中的作用奠定基础。１－．Ｃａｐ蛋白多克隆巧体的制备将Ｃｆｌ／７基因优化的密码子１１０８ｂｐ片段与未优化－－１０９７７４ｂｐ的片段进行融合ＰＣ民后，连接至ＰＧＭＴ载体，再亚克隆至原核表达载体ＥＴ－＋－ｐ３２ａ（）中，得到重组表达质粒ｐＥＴ３２ＣａｐＹ１０８，经

6、菌落ＰＣＲ，酶切和测序鉴Ｒｏｔ－ＩＰＴＰＡＧＥ定后，重组表达质粒转入表达菌ｓｅａ，经Ｇ诱导表达，ＳＤＳ分析表达情－ＮＴＡ－况。利用Ｎｉ柱亲和层析纯化蛋白，测定蛋白浓度，ＳＤＳＰＡ畑分析蛋白纯化效一果，利用感染ＤｕＣＶ鸭的阳性血清Ｗｅｓｔｅｒｎｂ，ｌｏｔ检测纯化蛋白并进步将纯化的蛋。７７４白免疫新西兰家兔，制备多克隆抗体结果表明：成功融合扩増出ｂｐ的－基因片段，构建重组表达质粒ｐＥＴ３２ＣａｐＹ１０８，经菌落ＰＣＲ、酶切和测序鉴定正确后，导入Ｒｏｓｅ化菌中，重组Ｃａｐ蛋白包涵体的表达形式存在，大小约为５０ＫＤ，一与预期大小致，浓０．

7、２８９ｍｍＬ，Ｗｅｓｔｅｒｎｏｔ。纯化后的重组蛋白条带较清晰度约为ｇ／ｂｌＣ一检测表明，表达蛋白为ａｐ蛋白，并且成功纯化。进步将纯化的Ｃａｐ蛋白免疫新西兰家兔后，ＥＵＳＡ检测１００００，ｌ抗体效价；８Ｗ上Ｗｅｓｔｅｒｎｂｏｔ利用制备多克隆抗体检测出Ｃａｐ蛋白条带，成功制备出其多克隆抗体，为后续研究提供了试验素材。２．脖母双杂交诱巧载体的构建将密码子优化后的Ｃｆｌ／７基因构建至酵母双杂交质粒７－ｐＧＢＫＴ中，构建重组质粒ｐＧＢＫＴ７Ｃａｐ，菌落ＰＣＲ及酶切鉴定正确后，转化酵母菌株Ｙ２ＨＧｏ，ｅｓｔｅｒｎｏｔ检，ｌｄ感受态利用Ｗｂｌ

8、测诱巧蛋白