人类多潜能干细胞体外分化红细胞发育过程中表型分子的研究

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1、長，京诚抑皆《像中刮令游＞博±研究生学位论文纖北京协和医学院研究生院学校代码：１００２３学号：Ｂ２０１２０巧００１博±学位论文人类多潜能干细胞体外分化红细胞发育过程中表型分子的研究所院：输血研巧所姓名：毛斌指导教师：马峰教授导师小组：陈波副教授；何苗副教授学科专业：免疫学研究方向：人类多潜能干细胞向红细胞定向分化完成日期：２０Ｕ年５月北京协和医学院／中国医学科学院博±研巧生学位论文目录中文巧要１英文巧要３论文正文—、前言６二、材料和方法１２Ｈ、实验结果２

2、９四＞讨论６７五、结论７２六＞参考文献７３＊、文献综述综述８２参考文献９６一附录；英文缩咯词表１０９附录二：个人简历１１１、在学期间学术成果？附录三致谢１１３附录四：论文独创巧声明１１４北京协和医学院／中国医学科学院博±研究生学位论文人类多潜能干细胞体外分化红细胞发育过程中表型分子的研究摘要研究目的：人类多潜能干细胞（ｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｄｌｓ，ｈＰＳＣｓ）主要包括人胚胎干细胞化ｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｈＥＳＣｓ）和人诱导

3、性多潜能干细胞（ｈｕｍａｎｎｄｕｃｅｄｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｈｉＰＳＣｓ）二者兼具体外自我更新、无ｉｐｌｐ，，限增殖及多分化潜能的特性，。它们的成功建株极大地推动了干细胞基础研究和临床应用研巧。研究的一个重要方向是将ｈＰＳＣｓ向特定谱系的成熟血液细胞定向诱导分化。一直没有合适的研究人类早期造血发生的模型因为，Ｗ往的研究主要都是基于小鼠等动物模型。ｈＥＳＣｓ体外诱导分化红细胞的过程，模拟了人类胚胎期体内红系一发生发育过程，为研究红细胞正常发育的调控机理奠定了实验基础，。另方面利用患者ｈｉＰＳＣｓ体系建立体外诱导分化红细胞的方法，

4、将为研究红细胞早期发育异常相关疾病的致病机理和开发个体化治疗手段提供理想的平台。在所有血细胞中，成熟红细胞因为不含细胞核，并携带着最小量的遗传物质，寿命较长等特点，有望作为最早的干细胞来源的细胞治疗产品而应用于临床。但在成功实现ｈＰＳＣ来源的红细胞临床应用前，还存在诸多问题需解决，例如：培养体系的不健全导致的体外扩增效率低、成熟程度低；脱核调控机制不明；没有合适的活体移植模型等。这些困难需耍通过对ｈＰＳＣ来源红细胞的发生和成熟过程中的关键调控机理的理解来攻克。为了精密地研充ｈＰＳＣｓ体外诱导分化红细胞的发育过程，在方法学上有两个亟待解决的

5、问题１）。（现有实验数据己显示不同诱导体系产生的红细胞成熟程度有差一异，ｓ。这种差异指向个事实即成体造血微环境来源的基质细胞的诱导对ｈＰＳＣ产一生成熟红细胞是必需的，。所需要建立套高效并趋于自然的共培养方法Ｗ得到类似于自然发育过程产生的成熟红细胞。（２）ｈＰＳＣ来源的红细胞分化培养体系中，同时存在原始造血及成体造血过程，并且红细胞在早期发育存在不同的发育阶段。一为了辨别不同的细胞，需要建立种快捷、方便且准确的标识方法。在成体干细胞向红细胞分化发育过程的研究领域，己成功利用表型分子来区分红细胞的不同发育阶段，启示我们也可能利用表型分子来区分ｈＰＳ

6、Ｃ来源红细胞的早期不同发育阶段。研究方法：我们比较了不同的成体造血微环境来源的基质细胞，选择了小鼠主动脉－－－ｒｔａ－ＧｏｎａｄＭｅｓｏｎｅｈｒｏｓ性腺中肾（Ａｏｐ，ＡＧＭ）细胞作为共培养体系的基质细胞。ＡＧＭ区域是最早的支持成体造血的位点。我们建立了将ｈＰＳＣｓ与ＡＧＭ来源的细胞系ＡＧＭ－Ｓ３体外向红细胞分化的培养方法。首先将ｈＰＳＣｓ细胞与ＡＧＭ－Ｓ３细胞系先共培养诱导造血分化的发生，再经悬浮培养向红细胞定向分化并扩增。成体＋Ｂ－ＣＤ３４来源的红细胞为对照，用先进的多色流式分析技术ｓ干细胞ｈＣ，探索ｈＰＳＣ１北京协和医学院／中国医学科学

7、院博±研巧生学位论文－Ｓ３共培养来源红细胞特异的表型分子表达谱系与ＡＧＭ。随后Ｗ分别表达特异表型＋－＋＋分子的红细胞亚群ＧＰＡＣＤ３６和ＧＰＡＣＤ３４为切入点，利用费光激活细胞分选（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｒｔｉｎＡＣＳｌＳｏ，Ｆ）技术ｇ，精确地将各目标细胞亚群分选－Ｇｍｎｗａ－出。然后利用瑞姬氏（ＭａｙｌｄＧｉｅｍｓａ，ＭＧＧ）染色方法观察细胞形态，通－过免疫芙光染色方法考察血红蛋白组分来评价红细胞的成熟程度，并采用ｑＲＴＰＣＲ技术检测造血及红细胞发育相关