小鼠诱导性多潜能干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的体外实验研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌大堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文储签名c矧协叮签字吼州年‘月丫日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采

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3、其病理变化主要是耳蜗毛细胞及与其相连的螺旋神经元的缺失。同时也有研究显示哺乳动物耳蜗毛细胞及螺旋神经元受损后再生十分困难。如果能够找到某种方法修复缺失的毛细胞或螺旋神经节细胞，就有希望治愈感音神经性耳聋。2006年，同本科学家ShinyaYamanaka等通过导入Oct3／4，Sox2，c．Myc，Klf4四个外源基因将小鼠体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPSCs)。多项研究证实，iPSCs具有与胚胎干细胞(ESCs)类似的分化能力，却可以避免ESCs的免疫排斥及伦理道德问题，因此我们将iPSCs在体外诱导分化为耳蜗毛细胞及螺旋神经元，为感音神经性耳聋的治疗的开辟新的道路。研究内容和方法：1

4、．iPSCs的培养与鉴定：取小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层，iPSCs接种于饲养层上胰酶消化传代，倒置显微镜下观察iPSCs生长状态，观察拟胚体(EB)形成能力，RT-PCR检测iPSCs多能性基因Oct4，Nanog，Sox2的表达情况。2．iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养及其分化细胞的鉴定：分离小鼠耳蜗Corti氏器，将iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养。对分化细胞用毛细胞的标志物(MyosinVIIA，Mathl，Calretinin，Espin)进行免疫组化鉴定。3．iPSCs与耳蜗蜗轴共培养及其分化细胞的鉴定：分离小鼠耳蜗蜗轴，将iPSCs与耳蜗蜗轴共培养，对分化细胞用神经元的标志

5、物(Nestin、Neurofilament．M、3-IIITubulin，VesicularglutamatetransporterI(VGluTl))进行免疫组化鉴定。结果：1．成功建立稳定的iPSCs培养体系，iPSCs体外培养可形成EB。RT-PCR显示iPSCs表达多能性基因Oct4，Nanog，Sox2。2．iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养18天后可得到表达毛细胞标志蛋白摘要MyosinVIIA，Mathl，Calretinin，Espin的细胞。3．iPSCs与耳蜗蜗轴共培养18天后可得到表达神经元标志蛋白Nestin、Neurofilament．M、3-IIITubulin

6、，VGluT1的细胞。结论：本实验成功建立稳定的小鼠iPSCs培养体系；共培养方法可成功将iPSCs诱导分化为耳蜗毛细胞样及螺旋神经元样细胞。关键词：诱导性多潜能干细胞；毛细胞；螺旋神经元；细胞分化Abstractobjective：ABSTRACTThemammalianinnerearhaslimitedregenerativeability．Theregenerationofauditoryhaircellsandauditoryspiralganglionneuronsisaprincipalrequirementforpotentialcellreplacementtherapy．I

7、nthisstudy，weinvestigatedthepotentialofmouseinducedpluripotentstemcells(iPSCs)foruseasasourceoftransplantsfortherestorationofauditoryhaircellsandspiralganglionneurons．Methods：WeCO—culturedthemouseiPSC