ano1在自发性高血压大鼠血管中的表达及作用研究

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1、分类号：Q46密级：非密UDC：610学校代码：11065博士学位论文ANO1在自发性高血压大鼠血管中的表达及作用研究王炳香指导教师曲志强教授学科专业名称生理学论文提交日期2015年4月13日论文答辩日期2015年6月5日答辩委员会主席苏学成教授ANO1在自发性高血压大鼠血管中的表达及作用研究摘要原发性高血压（EH）是一种独立的疾病，同时又是导致动脉粥样硬化、脑卒中等心脑血管疾病的高危因素，因此，如何有效的防治EH的发生发展对于预防心脑血管疾病至关重要。然而，到目前为止，由于EH的发病机制还不清楚，限制了临床上对EH疾病的防治。经典的钙激活氯通道（CaCC）广泛存

2、在于心血管系统中，参与调节心肌细胞兴奋性及血管平滑肌的舒缩功能。然而由于其编码基因未知，限制了经典CaCC在心血管系统中作用的进一步研究，直到Anoctamin1（ANO1）——anoctamins家族中的一员，被证实为经典的CaCC的编码基因，才开启了经典CaCC在心血管系统中的作用研究的新篇章。最新资料表明，ANO1编码的CaCC参与了对机体动脉血压的调节；然而，ANO1是否参与了EH的发病过程呢？目前未见报道。因此，我们以自发性高血压大鼠（SHRs）为EH的动物模型，针对ANO1在EH发生发展过程中可能发挥的作用进行如下探讨：（1）鉴定ANO1在SHRs不同

3、部位血管中的功能性表达的情况；（2）观察ANO1对SHRs血压的影响及可能的机制。研究内容及所用的实验方法：1．利用Westernblotting方法观察ANO1在SHRs不同部位血管组织中的表达；急性分离血管平滑肌细胞（VSMCs），利用全细胞膜片钳技术，记录VSMCsANO1依赖性的钙激活氯电流。2.利用Westernblotting方法检测ANO1是否存在糖基化修饰。3．组织贴块法原代培养大鼠VSMCs，观察ANO1的表达及功能。4.利用血管灌流方法，针对大鼠肠系膜动脉环进行研究，利用ANO1的特异性抑制剂T16Ainh-A01探讨ANO1对血管舒缩功能的影

4、响。5．利用siRNA-ANO1干扰技术减弱SHRs内源性ANO1的功能性表达，进一步观察ANO1对SHRs收缩压（SBP）及舒张压（DBP）的影响。6．利用MTT法，观察ANO1在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的VSMCs增殖中的作用；并利用原代培养的VSMCs，借助基因干扰技术进一步验证ANO1对VSMCs胞内钙信号的影响。实验结果：1.与Wistar-Kyoto（WKY）大鼠相比，在SHRs颈动脉、胸主动脉、肠系膜动脉及其分支、股动脉及其分支组织中，ANO1的蛋白（150kD±)表达均显著增多（P<0.01）；在原代培养的WKY大鼠及SHRs主动脉及肠系膜动脉

5、SMCs上ANO1的蛋白表达水平亦表现出相似的结果；2.与来源于WKY大鼠主动脉及肠系膜动脉的SMCs相比，在来源于SHRs胸主动脉及肠系膜动脉的SMCs，可记录到更加强的钙激活氯电流，表明在血管组织中表达的ANO1均为功能性CaCC。利用siRNA-ANO1减弱原代培养的SHRs肠系膜动脉的SMCs，所记录到的钙激活氯电流同未干扰的SMCs相比显著减弱；该结果表明，在VSMCs上所记录的钙激活氯电流是由ANO1介导的。3.给予糖苷酶F处理从SHRs及WKY大鼠胸主动脉中提取的蛋白后，检测发现ANO1的蛋白分子量由处理前150kD±下降至130kD±的水平，表明在

6、大鼠血管组织中的ANO1蛋白存在着糖基化修饰。4.分别给予1，2，5，10，20，30µmol/L的ANO1特异性抑制剂T16Ainh-A01预孵育SHRs及WKY大鼠肠系膜动脉环10min，然后给予1µmol/L的苯肾上腺素（PE）收缩血管。结果显示，10µmol/LT16Ainh-A01能够显著抑制PE诱导的WKY大鼠肠系膜动脉环的收缩，并且能够引起1µmol/LPE预收缩的血管舒张；而20µmol/LT16Ainh-A01则能够明显抑制PE诱导的SHRs肠系膜动脉环的收缩效应，表明可能是由于SHRs肠系膜动脉ANO1蛋白表达高于WKY，故需更大浓度的抑制剂才

7、能表现出明显的抑制效应。在原代培养的WKY肠系膜动脉SMCs，10µmol/LT16Ainh-A01能够减弱PE诱导的胞内钙荧光信号强度，说明抑制ANO1活性，可以通过降低VSMCs胞内钙来引起血管舒张。5.选取12周龄的SHRs和WKY大鼠，尾静脉注射ANO1特异性抑制剂T16Ainh-A01，检测40min内大鼠SBP及DBP的变化。结果显示，10µmol/LT16Ainh-A01能显著降低WKY大鼠的SBP和DBP；而20µmol/LT16Ainh-A01则能够明显降低SHRsSBP和DBP；鼠尾静脉注射siRNA-ANO1-Lipofectamin混合物，

8、减弱SHR