鸭胚成纤维细胞翻译延伸因子对鹅细小病毒增殖的影响

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1、分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：2012632硕士学位论文鸭胚成纤维细胞翻译延伸因子对鹅细小病毒增殖的影响InfluenceofTranslationExtensionFactorinDEFonProliferationofGooseParvovirus作者姓名：张双学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物病毒学指导教师：胡桂学教授所在学院：动物科学技术学院2015年6月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其

2、他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采

3、用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)病，又称小鹅瘟，是一种能引起雏鹅和雏番鸭发生急性或亚急性败血症的传染病，主要感染3-20日龄的雏鹅或雏番鸭。患病禽主

4、要表现为全身败血性病变，局灶型肝炎、心肌炎和栓塞性肠炎。剖检变化主要在肠道的空肠和回肠，形成卡他性、纤维素性、坏死性肠炎，肠道形成栓塞。该病流行面广，传播速度快、发病率和死亡率较高，给我国水禽养殖业造成很大的经济损失。为深入研究小鹅瘟病毒的复制机理，了解其在宿主细胞内的定植和复制机制，本实验室开展了GPV与细胞蛋白互作研究。构建了鸭胚成纤维细胞酵母双杂交文库，利用酵母双杂交技术以GPV的结构蛋白VP1为诱饵，筛选出3个阳性克隆质粒。其中，一个基因长度为593bp，经测序Blast在线比对，该基因与原鸡属的翻译延伸因子EEF1A1蛋白同源性高达96%。

5、为了进一步验证EEF1A1蛋白与VP1的相互作用，研究该蛋白对GPV增殖的影响，开展了本实验。构建原核表达质粒pET28a-EEF1A1（含His标签），进行原核诱导表达，SDS-PAGE分析，再用His标签树脂进行纯化。结果表明，纯化后的蛋白大小约为25kDa。将实验室构建的pGEX4T-1-VP1进行原核诱导表达，表达的VP1蛋白大小约为108kDa。采用GST-Pulldown蛋白互作技术，使EEF1A1与VP1形成了蛋白复合物，证明了在细胞外EEF1A1蛋白能与VP1蛋白结合。将原核诱导表达并纯化后的EEF1A1蛋白与GPV在细胞外感作，感染

6、鸭胚成纤维细胞（DEF）作为实验组，以单独GPV感染DEF作为对照组，24h后用荧光定量PCR方法检测GPV的核酸复制情况。结果表明，对照组GPV核酸复制拷贝数分别是实验组的2.3倍、5.4倍、7.7倍。由此说明，在细胞外，EEF1A1影响了小鹅瘟病毒在鸭胚成纤维细胞细胞表面的吸附，抑制了病毒的增殖。将pcDNA3.0-EEF1A1转染到DEF中，同时GPV感染DEF，作用12h和24h，分别设置单独GPV感染DEF细胞、GPV与空质粒pcDNA3.0、GPV与脂质体和GPV与高压灭菌水作为对照组，用荧光定量PCR检测GPV的核酸。结果表明，转染12

7、h时，实验组与对照组检测的GPV增殖含量差别不明显；转染24h时，实验组GPV的核酸拷贝量是单独GPV感染DEF含量的2.7倍。由此说明，在细胞内，EEF1A1表达量的增加促进了GPV的增殖。本研究结果为鹅细小病毒复制机制研究提供了有益资料。关键词：鹅细小病毒；翻译延伸因子；病毒增值；荧光定量PCRIAbstractGooseparvovirus(GPV)isthepathogenofgoslings,whichisalsonamedasDerzsy’sdisease.Itcausesacuteorsubacutesepticemiaofgoslin

8、gsandMuscovyducklingsaged3to20days.Sickgoslingsshowsys