区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP方法的建立-论文.pdf

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1、·56·生物技术中国畜牧兽医2014年第41卷第9期区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR—RFLP方法的建立万春和，潘异哲，陈红梅，施少华，傅光华，程龙飞，黄瑜(福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州350013)摘要：根据GenBank登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)非结构蛋白(NS)基因特征，本研究设计1对特异性引物对GPV和MDPV基因组DNA进行PCR扩增，目的片段大小均为810bp，并对PCR产物进行切胶回收。用EcoRI酶对GPV和MDPV特异性胶回收产物进行酶切鉴定，结果显示MDPV经EcoRI酶切后琼脂糖凝胶电泳检测

2、片段为2段，大小为530和280bp；而GPV经EcoRI酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。本研究建立了一种快速区别GPV和MDPV感染的检测方法，可对番鸭感染水禽细小病毒的情况进行快速鉴别诊断。关键词：鹅细小病毒；番鸭细小病毒；EcoRI限制性内切酶；聚合酶链式反应限制性片段长度多态性中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：l671—7236(20l4)09005603鹅细小病毒(gooseparvovirus，GPV)和番鸭细引物对GPV和MDPV进行PCR检测成本又较高。小病毒(Muscovyduckparvovirus，MDPV)属于细本研究根据GPV和MDPVN5基因特征设

3、计特异性小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒亚科(Parvoviri—引物，仅需1对PCR引物结合EcoR工酶切即可对nae)、依赖病毒属(Dependovirus)，均只有1个血清GPV和MDPV感染情况进行精确诊断。型。GPV是感染禽类的主要自主复制型细小病毒，1材料与方法由中国学者方定一于1956年首次在江苏扬州地区1．1毒株GPV和MDPV毒株均由福建省农业发现，以后在世界多国均见有相关研究报道(方定科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定并保存。15株一，1962；Dressy，1967)。该病主要侵害30日龄以GPV(包括番鸭源4株、鹅源11株)、5株MDPV均内的雏鹅和雏番鸭

4、，引起以急性肠炎及肝脏、肾脏、由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。心脏等实质脏器败血性病变，尤其是小肠部位的纤1．2试剂TransDirectAnimalTissuePCRKit、维性、栓塞性病变，是目前危害养鹅业和番鸭养殖业琼脂糖、琼脂糖凝胶回收小量试剂盒EasyPure的重要疫病。番鸭细小病毒病是由MDPV引起的，QuickGelExtractionKit和荧光染料GelStain均以腹泻、喘气和软脚为主要特征，主要侵害1～3周购自北京全式金生物技术有限公司；QuickCut龄雏番鸭，由林世堂等(1991)首次报道。此后，福建EcoRI、DL2000DNAMarker均购白宝生物工程

5、省农业科学院畜牧兽医研究所对番鸭细小病毒的病(大连)有限公司；其他试剂均为分析纯。原学、诊断学和疫苗学进行了大量研究报道(程由铨1．3引物设计与合成根据GenBank中登录的等，1993，1996；陈少莺等，2001)。GPV和MDPVNS基因结构特征设计引物，引物GPV和MDPV基因组均包含左右两侧2个开序列为：GMPVF1：5r_CAAAATAAGACCGT—放阅读框(openreadingframe，ORF)，位于左侧的GACT一3；GMPVR810：5'-ACACA3AGTAGGTTCAr_非结构蛋白(NS)和位于右侧的结构蛋白(VP)(张ACAAACA一3，预期扩增片段大小均为8

6、10bp。引物云等，2008；朱海侠等，2011)。其中GPV和MDPV由宝生物工程(大连)有限公司合成。的NS核苷酸同源性较高，针对NS基因设计PCR1．4病料的处理参照TransDirectAnimalTis—引物时对GPV和MDPV易产生假阳性，分别设计suePCRKit说明书进行操作，步骤为：在10OL收稿日期：2014—03—28AD1Buffer中加入25LAD2Buffer，混匀。用干作者简介：万春和(1982)，男，湖北人，博士，助理研究员，研究净无菌的剪刀将待检样品组织剪碎后，加入AD1与方向：水禽病毒分子生物学。AD2的混合液，混匀。55℃孵育10min，95℃孵育通信

7、作者：黄瑜，研究员。E—mail：huangyu一815@163．com；Tel：0591875723963min。加入100FLAD3Buffer，混匀后直接作为基金项目：公益性行业(农业)科研专项经费(2010030l2)。模板进行PCR。·58·生物技术中国畜牧兽医2014年第41卷第9期表IGPV和MDPV的PCR-FRLP符合性试验GPV和MDPV进行基因组学研究分析发现，GPV和MDPV的同源性较高，GPV能