鹅细小病毒非结构蛋白ns1与鹅胚成纤维细胞蛋白互作的研究

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1、分类号：单位代码：10193密级：学号：2010711博士学位论文鹅细小病毒非结构蛋白NS1与鹅胚成纤维细胞蛋白互作的研究ResearchonNon-structureProteinNS1ofGooseParvovirusInteractionwithProteinsofGooseFibroblasts作者姓名：孟繁兴专业：预防兽医学研究方向：分子病毒学指导教师：胡桂学教授所在学院：动物科学技术学院2015年11月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其

2、他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日摘要鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属成员，该病毒主要侵害3周龄内的雏鹅和雏番鸭，故引起的疾病被称为小鹅瘟。该病最早见于我国学者方定一的报道，具有传播快、死亡率高的特点。3-20日龄的雏鹅和雏番鸭易感性高

3、，死亡率可达90%-100%。发病日龄越小死亡率越高。鹅细小病毒基因全长约5kb，基因组包括左右2个开放阅读框，其中左侧开放阅读框编码非结构蛋白，包括NS1和NS2。其中，NS1基因由1884个核苷酸组成。NS1在病毒的致病性、复制及调节表达方面发挥了重要的作用。NS1为磷酸化蛋白，同参与调节启动子的细胞因子结合，在鹅细小病毒DNA早期复制过程有多种功能；NS1可与病毒DNA复制起始序列高亲力结合,对病毒DNA的复制是必须的；NS1可抑制细胞DNA的复制且对衣壳蛋白的启动子起正调节作用，除此之外NS1可对P41启动子起负调节作用。目前国内外研究的热点主要集中

4、在GPV结构蛋白，对于非结构蛋白的研究较少。本实验构建了NS1表达载体，开展了NS1蛋白与鹅胚成纤维细胞蛋白互作研究，旨在为阐明GPV病毒复制的分子机制提供科学依据。本研究共分为以下四个部分：1、鹅细小病毒梨树分离株的分离鉴定及其NS1基因序列测定与分析：采用鹅胚从吉林省梨树县疑似小鹅瘟死亡雏鹅的临床病料中分离到1株病毒，经电镜负染观察和GPV特异性PCR引物鉴定，证明所分离病毒为鹅细小病毒，命名为GPV/2010/LS株。扩增并克隆了GPV/2010/LS株非结构蛋白NS1基因。序列分析表明，该毒株NS1基因及其氨基酸序列与台湾分离株82-0321、上海分

5、离株SHFX1201、扬州地区分离株YZ99-6和长春分离株CH同源性很高，且NS1基因相对比较保守。2、鹅胚成纤维细胞与GPVNS1蛋白互作蛋白的筛选及鉴定：利用Clontech公司的SMART技术，快速、高效的构建了鹅胚成纤维细胞cDNA文库。采用酵母双杂交技术，以非结构基因NS1为诱饵蛋白，成功构建重组载体pGBKT7-NS1，用该诱饵载体筛选构建了鹅胚成纤维细胞cDNA文库。利用多重筛选培养基SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA、SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal/AbA筛选出阳性酵母双倍体，拯救酵母双倍体文库质

6、6粒，送生物公司测序，并对测序结果比对分析。结果显示，构建了浓度为4×10pfu/mL的鹅胚成纤维细胞cDNA文库。构建了重组载体pGBKT7-NS1，并表达和验证。从鹅胚成纤维细胞酵母双杂交文库中筛选出两种与鹅细小病毒NS1互作蛋白并测序，在线Blast鉴定为由411个碱基对编码的核糖体S12蛋白（命名GEF/2011/GP1）和由296个碱基对编码的未知蛋白（命名GEF/2011/GP2）。3、鹅胚成纤维细胞GP1和GP2与小鹅瘟病毒NS1相互作用的GST-pulldown验证：构建了pGEX-4T-1-NS1原核表达质粒，表达出95kDa大小的NS1蛋

7、白。构建了IpcDNA-3.0-Flag-GP1和pcDNA-3.0-Flag-GP2两个真核表达质粒，并成功获得表达。利用GST-pulldown技术验证，GPVNS1蛋白能与鹅胚成纤维细胞GP1和GP2蛋白相互作用。为后期研究GP1和GP2在鹅胚成纤维细胞内外对GPV增殖的影响奠定了基础。4、与GPVNS1互作的鹅胚成纤维细胞蛋白对GPV增殖的影响：本实验已经通过GST-pulldown技术确定GPV与鹅胚成纤维细胞互作的GP1和GP2蛋白，为了进一步研究这两种蛋白对GPV的复制影响，我们进行了两方面研究。一是在GEF细胞外，LS株GPV与纯化后的GP1

8、和GP2蛋白相互作用再感染GEF细胞，采用SYBRG