犬细小病毒ns1非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究

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河北农业大学硕士学位论文犬细小病毒NS1非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究姓名：潘红丽申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：仲飞20120531 摘要犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canineparvovirus，CPⅥ引起的一种急性传染病。此病主要表现急性出血性肠炎和急性心肌炎，传染性强，发病率和死亡率高，是一种危害犬，特别是幼犬的一种重要的传染性疾病。近20多年来，国内外学者对犬细小病毒病的流行病学、病原生物学、诊断和防治方面进行了大量研究，但是，目前对犬细小病毒病的发病机制了解甚少。已有研究证实，在体外CPV感染猫肾细胞NLFK和犬纤维瘤细胞A72可以引起细胞凋亡，在体内CPV感染可诱导肠粘膜上皮细胞的凋亡和坏死，进而引起继发感染。为了研究犬细小病毒非结构蛋白NSl在CPV引起宿主细胞凋亡中的作用，初步探讨CPV引起细胞凋亡的机制，需要表达NSl蛋白。为获得具有生物活性的NSl蛋白，我们选用真核表达系统，把重组质粒转染入细胞瞬时表达NSl蛋白。本实验首先参考GenBank已发表的犬细小病毒非结构蛋白NSl基因的序列，设计2对引物，以犬细小病毒的基因组为模板，采用PCR方法扩增NSl编码基因，将该基因片段克隆到pcDNA3．1A载体中，构建成下游融合6xHis的融合表达载体pcDNA．NS1／His和非融合表达载体pcDNA．NS1，融合表达载体pcDNA．NSl／His通过转染HEK293FT细胞瞬时表达NSl重组蛋白，用Western-blot检测以确定重组NSl蛋白能否在真核细胞中进行表达。然后用CPV感染和用pcDNA-NSl表达载体转染F81宿主细胞，通过AnnexinV／PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻和通过化学发光法检测caspase．3／7活性，分析感染CPV或转染NSl基因对F81宿主细胞凋亡的影响。结果表明，本实验扩增的NSl基因序列与GenBank的序列一致，构建的表达载体结构正确，并能够介导NSl基因在真核细胞中表达。感染CPV和转染NSl基因均能诱导F81细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和明显提高细胞内caspase．3／7的活性，表明CPV和NSl蛋白均能引起细胞的凋亡。综上所述，犬细小病毒的NSl非结构蛋白可诱导细胞凋亡，这为进一步研究CPV诱导细胞凋亡的分子机制提供了重要的实验基础。关键词t犬细小病毒；NSl蛋白；真核表达；细胞凋亡 StudyonNon—structuralproteinNS1ofCanineParvovirusInducingApoptosisinHostCellsGraduateStudent：PanHongliAdvisor：Prof．ZhongFeiMajor：BasicVeterinaryMedicmeAbstractCanineparvovirusdiseaseiSarlacuteinfectiousdiseasewhichcausedbycamneparvovirus(CPV)．Acutehemorrhagicgastroenteritisandacutemyocarditiswithhighmorbidityandmortalityisthemostcommonmanifestationofthedisease，whichisharmfultodogs，especiallytopuppies．Therefore，itisanveryimportantinfectiousdisease．However,themolecularmechanismofcanineparvovirusdiseaseisnotentirelyclear．IthasbeenprovedthatCPV—infectioncaninduceapoptosisinintestinalepithelialcellsfi'omCPV—infectedanimals，andtherebycausesecondaryinfection．Toinvestigatetheeffectsofcanineparvovimsnon·structuralprotein一1(NS1)onthecellapoptosisinducedbyCPVandpreliminarilyexplorethemechanismofCPV·inducedapoptosis，theexpressionofNS1proteinisneeded．WeselectedeukaryoticexpressionsystemtoobtainNS1proteinwithbiologicalactivity．First，theNS1geneWasamplifiedbyPCRfromCPVgenomicDNAandsubclonedintopcDNA3．1AvectortogenerateNS1eukaryoticexpressionvectorpcDNA-NS1／HisandpcDNA-NS1．ToverifywhetherpcDNA-NS1／HisvectorCanmediateNS1expressionineukaryoticcells，thehumanembryokideny(HEK)293FTcellswereusedtotransientlyexpresstherecombinantNS1protein．111eeffectsofNS1onCPV-inducedapoptosiswereinvestigatedbyinfectingtheF81hostcellswithCPVandtransfectingthecellswithNS1vector．TheapoptosisofthecellsWasdetectedbyAnnexinV／PIdoublestainingforphosphatidylserineexternalizationonmembraneandbyluminescencemethodforcaspase-3／7activities．111eresultsshowthatthesequenceofNS1geneamplifiedWasconsistent、历廿1theGenBank．TheNS1expressionvectorWasshowntobecorrectandcouldmediateNS1expressionineukaryoticcells．Thephosphatidylserine(PS)onoutsideofmembranewasdetectedandthecaspase-·3／7activitieswereincreasedinbothCPV··infectedcellsandNS1一transfectedcells．TheseresultsindicatethatbothCPVandNS1proteinCaninducetheapoptosisofthecells．Insummary,canineparvovirusNS1proteinCaninduceapoptosis，whichlaidsthefoundationforfurtherinvestigationofthemolecularmechanismofcanineparvovirusdisease．Keywords：canineparvovims；NS1protein；eukaryoticexpression；cellapoptosis 缩略词 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究1．1犬细小病毒病的研究进展1引言犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)引起的一种具有高度接触性的烈性传染病，此病主要表现急性出血性肠炎和急性心肌炎【11，传染性强，发病率和死亡率高。该病表现为发热(40℃以上)、精神沉郁、不食、呕吐、腹泻、排出恶臭的粪便并伴有白细胞大量减少等症状，死亡率可高达20％-100％121，是危害我国养犬业最为严重的传染病之一【3l。自1978年首次发现该病后，该病在世界范围就广泛传播。CPV与另外一种细小病毒——猫细小病毒非常相似，它们衣壳蛋白的氨基酸序列有98％的同源性【41。CPV与浣熊和狐狸的细小病毒及貂肠炎病毒也高度相似【5】。CPV不仅感染犬、狼、狐狸等犬科动物，还可感染猫、熊、豹、果子狸、虎等其它多种肉食动物[61。自然感染主要通过直接和间接接触而感染。病毒污染食物、垫料和环境等成为传染源，发病率为20％100％，致死率为10％～50％，4周龄以内死亡率最高。康复犬的粪尿中长期带毒，以及隐性感染的犬也带毒，都是危险的传染源【l】。近20多年来，国内外学者对犬细小病毒病的流行病学、病原生物学、诊断和防治方面进行了大量研列¨】，如美国康奈尔大学Parrish实验室对病毒的病毒宿主漂移机制、感染机制等进行了系统研究[9-10]；在中国，多家研究机构如长春军事兽医研究所等多年来对我国病毒的诊断、流行毒株的鉴定及其疫苗的制作等进行了广泛的研究【ll。121，然而，目前对犬细小病毒病的发病机制了解甚少。1．1．1犬细小病毒的发现犬细小病毒最早是1977年由美国学者Eugster和Naiml从患出血性肠炎的病犬粪便中观察到的【13】。1978年，加拿大的Thomsontl铂和澳大利亚的Kellyll51同时从患肠炎的病犬粪便中分离获得的犬细小病毒。随后短短几年内英国、德国、法国、意大利、俄罗斯和日本等国也相继发现了该病掣幡1引。为区别于1967年由Binn等㈣从健康犬粪便中分离到的犬极细小病毒(Mmumvirusofcanine，MVC)(也称作CPV．1)，而将后来发现的病毒命名为犬细小病毒2型(CPV．2)。CPV-2与CPV．1在致病性及抗原性上具有显著的差异。临诊上，CPV一2有两个表现类型120J：肠炎型和心肌炎型。肠炎型主要表现为严重的呕吐，急性出血性肠炎、白细胞显著减少，但目前临床上有相当大比例患病犬白细胞表现正常或升高；心肌炎型主要见于8周龄以下的幼犬，可以导致幼犬呼吸与心血管的衰竭，常突然发病，数小时内死亡。在中国，梁士哲等【2l】于1982年首次发现了类似CPV．2感染所致出血性肠炎。次年，徐汉坤等【22】正式报道了犬细小病毒病在中国的流行。近年来，随着我国宠物犬、实验用犬和工作犬(军犬、导盲犬、警犬等)饲养量的大幅增加，犬细小病毒感染日趋严重，给养业犬带来了重大的经济损失，成为危害养犬业严重的疫病之一。自1978年首次分离获得CPV以来，随后其抗原不断经过漂移产生新的突变株。1980年以后的分离株在某些方面的选择优势明显胜于其母代毒株，实际上在80年代中期已被其取代了。美国学者Parrish等【23．24】将新的分离株命名为CPV．2a，以表明其是CPV．2的亚型。至1984年，随着单克隆抗体技术的兴起，美国通过CPV特异性单克隆抗体筛选到新变异株，即CPV．2b。最近1 河北农业大学硕士学位(毕业)论文、又从猫中分离出一种新型的CPV，命名为CPV一2c，但不确定其是否会感染犬，推测其可能是由CPV一2a或CPV．2b变异而来【25】。1．1．2犬细小病毒的分子生物学特征1．1．2．1犬细小病毒的形态结构CPV是细小病毒科，细小病毒亚科，细小病毒属的成员【l】，具有细小病毒属的典型结构和形态。CPV病毒颗粒直径约为26n121，无囊膜，为等轴对称二十面体。病毒在电镜下呈圆形或六角形(如图1．1)，衣壳由32个长约34nnq的颗粒组成。完整CPV一2的农壳结构已经通过x．射线晶体学测定，主要特征是：在三倍体对称轴上有一个突起(Spike)长约2．2nm，直径为7nm；五倍体对称轴上形成圆筒形结构，由五对反平行的B链组成，每对反平行的13链之间有氢键连接；圆筒形结构的内部直径约为11．3nm_1．4rim。在两个三倍体突起之间的二倍体对称轴上有一条凹陷(Dimple)，深1．5nnl；在每个五倍体对称轴上的通行结构外边环绕着--d,峡谷(Canyon)，宽1．1am，底部距顶点的距离是0．9nm，高1．5nm的嵴从二倍体对称轴处将裂谷分开【2∞71。图1一ICPV的立体结构图Fig．1-IStereoviewsoftheimagereconstructionoftheCPVt27】1．1．2．2犬细小病毒的理化特性及培养特性CPV对外界环境具有很强的抵抗力，这与其化学组成和结构特点有关。CPV是无囊膜病毒，不含脂质和糖类，结构紧密。在4---10"C下，可存活180d；在室温下能存活3个月，在60℃能活1h，能耐受65*C30min而不丧失其感染性。粪便和固体污染物的病毒可存活数月至数年。CPV对常用消毒剂和多种理化因素具有较强的抵抗力。对氯仿、乙醚和醇类有抵抗力，并且其感染性和血凝性都不受影响。消毒剂可以灭活CPV，最有效的是福尔马林、紫外线、次氯酸钠、氧化剂和氟化剂等。CPV的VP2蛋白构成衣壳蛋白主要成分，具有血凝活性。CPV在温度4～25。C，PH6．0～7．2的条件下能凝集猫、猪、恒河猴、马和仓鼠的红细胞；不能凝集牛、兔、山羊、豚鼠、大鼠、小鼠、地鼠、鹅、鸡和人的。型红细胞【28】。2 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究CPV在犬和猫的肠、肺、肾的原代和传代细胞中均能较快增殖，也能在原代、次代犬胚胎的脾细胞、胸腺细胞，浣熊的唾液腺细胞，牛胎脾以及水豹肺细胞系(CCL-64)等有丝分裂旺盛的细胞中繁殖。近年常用F81(猫肾细胞)和MDCK(犬肾细胞)等传代细胞分离培养CPV。CPV于3712培养l-2d后可引起F81细胞明显的细胞病变，表现细胞变圆，脱落、崩解和破碎【291。CPV也能在MDCK细胞内增殖，但在MDCK细胞中培养，无明显的病变出现，有时出现细胞圆缩，并常形成核内包涵体【30】。轻度染毒的细胞仍可继续生长传代，经3~5代后会出现明显的细胞病变。1．1．2．3犬细小病毒的基因组结构CPV是一种自主复制的细小病毒，其基因组是单股、负链、线形DNA。基因组含有5323个核苷酸【311，是DNA病毒中最小的。基因组含有两个开放阅读框(ORFs)，第一个ORF由基因组左半部分，编码早期转录的调节蛋白——非结构蛋白NSI和NS2；第二个ORF位于基因组的右半部分，编码病毒衣壳蛋白——结构蛋白VPl和VP2。两个ORF分别有自己的启动子，非结构蛋白和结构蛋白的mRNA终止于共同的Poly(A)末端，通过mRNA的可变剪接形成不同的翻译模板。CPV更显著的特点是基因组结构末端有发夹结构，该结构在病毒复制有重要作用。位于3’端的回文序列大约115bp，这种DNA片段自身能够反折以形成一种发夹结构，这种结构较自身互补链间的氢键稳定；5‘端也是回文结构，并且能形成发夹【4'321，并且高度磷酸化，这种结构可能与保护病毒基因组不被降解有关。细小病毒的DNA复制一般发生在细胞核内，细胞周期的S期进行复制。这是由于病毒复制能力有缺陷，细小病毒DNA复制完全依赖于宿主DNA聚合酶及其复制体系，需在宿主细胞的染色体复制开始后在细胞核内合成【331。利用DNA聚合酶抑制剂处理宿主细胞，发现细小病毒DNA在宿主细胞内不能进行复制，说明细小病毒DNA复制需要利用宿主DNA聚合酶。在宿主DNA聚合酶的作用下，病毒DNA以滚发夹模式进行复制，它通过自身DNA末端回文序列所形成的反转回折3’端作为引物，起始DNA合成【351。1．1．2．4CPV编码的蛋白及功能CPV主要编码四种蛋白，分别为早期蛋白——非结构蛋白NSI和NS2，晚期转录物翻译的结构蛋白VPl和VP2。病毒粒子中包含3种多肽VPl(83kD)、VP2(67kD)和VP3(65kD)，空衣壳蛋白中只含有VPl和VP2两种蛋白质。VP3仅仅存在于完整的病毒粒子衣壳蛋白中，是由VP2蛋白氨基端水解掉15---20个氨基酸形成的，只在病毒衣壳装配和病毒基因组包装后出现，其相对量随着病毒的感染进程和发展而增加。CPV粒子表面由60个VPl和VP2交替的基序构成，VP2占90％，而VPl只占10％，因此VP2是构成衣壳蛋白的主要成分。非结构蛋白是CPV最先合成的病毒蛋白【34】，细小病毒的非结构蛋白主要负责对基因表达行使调控作用。NSl蛋白是CPV的一个主要的非结构蛋白，也是一个多功能的基因表达调控蛋白。研究表明，犬细小病毒的NSI蛋白通过与ATP结合和释放，促进识别并结合特异性DNA序列，从而对病毒基因复制和表达进行反式激活[35-361。NSl蛋白和NS2蛋白合成后，均可进行磷酸化，保护病毒基因组不被降解。结构蛋白是犬细小病毒合成的晚期蛋白【371，Vial(由727氨基酸组成)分子比VP2(由584氨基酸组成)大，二者的基因编码序列相互重叠，终止于同一个密码子。犬细小病毒的结构蛋白主要负责构成病毒粒子的衣壳，有研究报道衣壳蛋白在昆虫细胞中合成时，能够自我组装形成病3 河北农业大学硕士学位(毕业)论文毒粒子【3引。对CPV结构蛋白进行高分辨率的X射线分析后，阐明了CPV衣壳蛋白二级结构和空间结构【39J：CPV的衣壳是由8组反向平行的P折叠和4个镶嵌其中的大环组成。环l、3、4分别来自三个不同的VP2分子，它们彼此紧密靠近、延长、相互作用形成三倍体亚单位，从而使得这些亚单位高度缠绕在三倍体轴附近形成一个2．2nln高的突起，病毒的抗原性相关的残基分布于这些突起上。四个环构成病毒衣壳表面的大部分，已有研究报道，氨基端大部分离开五倍体轴而位于衣壳外表面，现已发现另一个重要的抗原位点位于这些氨基端。从抗原角度来看，环的结构决定了病毒的两个重要的中和位点。位点A来自同一VP2的环l，环2以及三倍体分子环4。环2在形成位点A时表现为222、224位点的变异。位点A涉及的抗原漂移是通过环4上的426位点残基的变异，使CPV形成2a型和2b型。位点B位于环3的延长部分，三倍体突起的肩部，包括299、300、302位点残基的变异。实际上，CPV的300位点残基是最容易发生突变的残基。单克隆抗体识别这两个决定簇影响血凝抑制，然而，这些改变不影响体内交叉保护。结构蛋白在病毒感染过程中起着非常重要的作用，犬细小病毒表面的VP2蛋白能够与宿主细胞表面的转铁蛋白受体ffransferrinreceptor，Tm)进行特异性结合，通过网格蛋白介导的内吞途径使病毒进入细胞；缺失VP2蛋白或VPl蛋白的突变体均丧失了对宿主细胞的感染性。1．1．3犬细小病毒的致病机理犬细小病毒是一种无囊膜，含有单链线性DNA的病毒，其进入细胞的方式和大多数无囊膜病毒一样，通过网格蛋白介导的细胞内吞作用来完成的[401。犬细小病毒首先结合至宿主细胞的TfR，进而通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞内部。在细胞内病毒粒子会遭遇一个酸性环境，病毒衣壳蛋白的构象发生改变，病毒脱衣壳，DNA释放进入细胞核f411。随着宿主细胞的复制和表达，犬细小病毒也开始进行复制和表达。首先是早期蛋白——-NSl和NS2非结构蛋白表达，然后结合于基因组特异DNA序列，反式激活病毒结构蛋白的表达。衣壳蛋白的合成是在胞质中完成，但只有在细胞核内才能和基因组一起组装成有复制功能的病毒。病毒结构蛋白的核转运对病毒进入、复制和感染过程中具有重要作用。国内外学者对CPV感染进行了详细的研究，易感犬接触病毒后，病毒最初由鼻和口咽部(包括扁桃腺及其它淋巴组织)侵入犬体内1421。动物可经非肠道的实验方式感染，但是口腔是最主要的自然感染方式。病毒通过血流传播抵达其他器官，l～3天后病毒可出现在扁桃体(tonsil)、胸腺、咽淋巴结和胸淋巴结【l61，感染3天后，肠相关淋巴结组织也有病毒的出现，感染4．9天后病犬可作为传染源向外排毒。因为病毒对肠粘膜上皮细胞的吸收无影响，且肠粘膜上皮细胞感染是发生在病毒血症，因此，中和抗体进入循环系统后能减小感染的肠粘膜范围，然而抗体水平不是很高时却不能阻止感染。在CPV感染中细胞因子可能发挥重要作用，但目前没有相关报道。CPV在动物体内主要攻击两种细胞【43】：肠上皮细胞和心肌细胞。这是因为这些细胞表面具有转铁蛋白受体(T瓜)，能够介导病毒进入细胞。CPV感染肠隐窝胚上皮组织后，引起上皮组织破坏，甚至萎陷，导致正常的细胞无法更新，肠绒毛变短、病犬呕吐和腹泻。肠腺上皮细胞也有不同程度的坏死、脱落。CPV感染心肌细胞后，病毒在心肌细胞大量快速的增殖复制，心肌细胞变长、变细，局部断裂、崩解，问质水肿，心肌毛细血管扩张、充血。淋巴坏死和骨髓增殖细胞也受到损伤，从而导致淋巴细胞减少；感染严重的情况下，常常出现淋巴细胞减少症和中性粒细4 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究胞减少症。病犬能很快对犬细小病毒产生免疫应答，临床症状一出现，即可检出犬细小病毒血清抗体，在临床发病期间迅速达到高峰。随着进入肠道的Igi和肠黏膜Igk等CPV特异抗体的增多，散在的病毒被凝集在一起，感染性降低。在感染急性阶段幸存下来的犬，通常能很快完全地从肠炎病状康复。迅速的免疫应答标志着病犬已经进入了最严重的临床症状阶段，能够限制病毒血症的程度和持续时间的动物，其症状就会较缓和，康复的机会就比较大。反之，康复的机会较小。康复犬获得的被动免疫是长期的、完全的，间隔2年再受到攻击仍能抵抗犬细小病毒的感染。1．1．4犬细小病毒病的流行病学犬细小病毒主要感染犬，特别是断奶前后的幼犬，疫病几乎全部出现于4周至6个月的幼犬。4^6周龄的犬感染CPV后因心肌炎致死的较多；8～10周龄的犬则以出血性肠炎为主。小于4周龄的仔犬发病率较低，一般为2％，这是因为生后前几周可以依靠母源抗体得到保护，所以较少发病。然而，当母源抗体效价下降时，如果幼犬没有进行适时免疫，就会容易被感染。实际上，所有成年犬已经获得免疫(疫苗免疫或自然感染)，但近年也常常发生成年犬因出血性肠炎而死亡的严重病例Ⅲ】。感染后采用减毒疫苗免疫可获得长期保护(2年以上)或终生保护。犬细小病毒病的主要传染源是病犬，病毒随唾液、呕吐物、粪便等排出体外，污染饮水、垫料、饲料以及周围环境【45】，康复犬仍可通过粪便长期向外排毒，粪便中含毒量最高，并且犬细小病毒在外界环境中可长期存活(5~7月)，并且普遍存在。健康易感犬直接接触病犬、带毒犬或摄入污染的食物和水，病毒就会通过消化道而感染动物体。另外，人工注射、肌肉接种或静脉接种也能引起本病的发生。当大量犬被感染后，环境中的病毒数量随着越来越多的犬被感染，而得到大量增殖，以致于感染量增加，直到所有易感犬均被感染。地方性犬细小病毒病循环存在于野生犬和群体饲养犬群中。犬细小病毒病一年四季均可发生，但以天气寒冷的冬季和春季较易发生。阴雨寒冷、饲料品质不良、气候突变、暴饮暴食、哺乳仔犬均可感染发病，但洋种犬(含改良犬)发病率高于土种犬，占发病犬的95％以上，且疗程长，难治愈。1．1．5犬细小病毒病的病理特征及临床症状1．1．5．1犬细小病毒病的病理特征肠炎综合症尸体的病变主要见于回肠和空肠。剖检可见小肠中段和后段肠腔扩张m】，浆膜下方出血变为暗红色，肠系膜血管呈树枝状充血。在有些病例中，整个小肠表现充血和明显出血，小肠粘膜出血、坏死、甚至脱落，内容物呈酱油样或果酱样。淋巴结肿胀、出血，切面呈大理石样。胸腺呈萎缩、水肿状态，肝、脾仅见淤血变化。心肌炎综合征尸体的病变主要限于肺和心脏。肺部水肿，局灶性充血、出血，致使肺表面色彩斑驳。心脏扩张，心房和心室内有瘀血块。心肌和心内膜有非化脓性坏死灶。心肌纤维严重损伤，常见出血性斑纹。肠炎综合征组织学检查较突出的变化是小肠和大肠粘膜变性、坏死，甚至脱落，毛细血管充血，绒毛萎缩，隐窝萎陷或扩张，固有层有充血、出血和炎性细胞浸润，上皮细胞中有时还可发现包涵体【4丌。淋巴组织严重坏死、衰竭。脾红髓和白髓界限不清，皮窦、髓窦充血、出血，生发中心萎缩，甚至消失。胃粘膜上皮变性、坏死和脱落，毛细血管充血。胸腺间质水肿，皮质细胞5 河北农业大学硕士学位(毕业)论文减少，胸腺小体发生玻璃样变化；肾毛细血管充血，肾小管上皮细胞颗粒变性，呈管型存在。肝脂肪变性、肝细胞核浓缩、破裂及崩解。心肌炎综合征的组织学特征则主要为心肌纤维的弥漫性淋巴细胞浸润，间质有时因毛细血管充血而肿胀，局限性心肌纤维颗粒变性，呈典型的非化脓性心肌炎变化，心肌损伤部位的细胞内可见核内包涵体和CPV粒子。1．1．5．2犬细小病毒病的临床症状肠炎型犬细小病毒病又称出血性肠炎型犬细小病毒病，自然感染的潜伏期一般为7～14d。该病主要表现为剧烈呕吐、沉郁、急性出血性肠炎和白细胞显著性减少等症状。病初犬精神沉郁，厌食，突然呕吐，体温升高可达40ql℃。起初呕吐物为食物，随后呈粘液状、黄绿色或有血液。病初粪便呈灰色，黄色或乳白色，混有粘液和伪膜，随着排便次数增多，3~4d后病犬排出恶臭的酱油样或番茄汁样血便，频频排出少量的呈粘液状、鲜红色或暗红色脓样粪便。健康犬接触病犬后，要进行紧急预防接种或注射高免血清。病犬的犬舍和器具可用1％福尔马林，2％--4％烧碱，或5％一6％次氯酸钠反复消毒，并空关1个月。对无治愈可能的犬应及早扑杀，焚烧深埋。在CPV感染流行的季节，要注意犬的卫生、饮食和保暖，增强犬的抵抗力。免疫犬时要严格按免疫程序，并注意疫苗合理地运输、保存和使用。1．1．6犬细小病毒病的防治措施在犬细小病毒的预防方法研究上，病毒学家最早使用的是经福尔马林灭活的猫泛白细胞减少症(FPV)疫苗，也使用过猫泛白细胞减少症弱毒疫苗。研究表明【4引，虽然CPV和FPV之间有共同的抗原组成，也能发生交叉血清学反应，但FPV的免疫效果远远不如CPV，因而，随后又相继研究出CPV灭活疫苗和弱毒疫苗。国内外学者纷纷对犬细小病毒进行迸一步的深入研究，致力于寻求更安全更有效的疫苗。当前，基因工程疫苗及核酸疫苗的研究已经取得了较大的进展[49-50]。LopezJA等【5l】在昆虫杆状病毒表达系统中表达了CPVvP2蛋白，研究发现10lag的体外表达蛋白就可使犬获得良好的免疫效果；LangeveldF等【52】合成的位于VP2氨基端的21个氨基酸，内有部分重叠两段多肽，分别免疫犬后，均能产生免疫保护作用。但是，由于异源灭活，异源弱毒苗和基因工程疫苗都存在不足之处，所以目前国内主要采用犬五联弱毒疫苗或CPV灭活苗对犬细小病毒进行免疫。对于犬细小病毒患犬来说，发现肠炎型病例应立即隔离饲养，加强护理，采用对症治疗、支持疗法和防止继发感染等措施。支持疗法应是基础，并且遵循治疗任何急性肠炎的一般原则。对本病的治疗以补充血容量、纠正体液酸碱平衡紊乱、抑杀病毒、控制继发感染为治疗院则，并结合对症疗法。病初可选用血清或犬细小病毒抗体紧急注射以降低病毒量，同时针对出血性肠炎和脱水症状对病犬抗菌消炎、补液强心、止泻、止吐和止血等中西医结合对症治疗。最后注意禁食、保暖等护理，腹泻期间对病犬停喂牛奶、鸡蛋等高脂肪高蛋白食物，以减轻胃肠负担，提高治愈率。此外，VirginieM，WojciechN等人【53】利用重组的猫∞干扰素对攻毒幼犬进行治疗，效果良好。CPV感染症的特点是病程急，恶化迅速，发现此病，应立即进行综合治疗。1．2细胞凋亡的研究进展6 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究1．2．1细胞凋亡概述细胞凋亡是生物体内细胞在特定的内源和外源信号的诱导下，由相关基因调控发生的程序性自主死亡(programmedcelldeath，PCD)过程。其形态学变化首先是细胞体积缩小，与周围的细胞分离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞质中，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约200bp片段；细胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；细胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为凋亡小体，无内容物外溢，因此不会引起周围组织的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间保守性强，如caspase家族、Bcl．2家族、C-myc癌基因、抑癌基因p53等，随着分子生物学技术的发展，对多种细胞凋亡的过程有所了解，但迄今为止凋亡的确切机制尚不完全清楚，而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有关联，如肿瘤、自身免疫性疾病，病毒感染等，都能够诱发细胞凋亡。细胞凋亡是一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的细胞或异常的细胞中起着必要的作用。它在维持内环境的稳定、生物体的进化以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子机制。1．2．2细胞凋亡的基因调控细胞凋亡在基因的调控下进行，其相关基因很多，主要包括以下三类凋亡相关基因：(1)促细胞凋亡基因：Ced3、Ced4，ICE(IL．1beta．convegingenzyrne，ICE)家族，Fas和FasL，Bcl．2(B-celllymphoma／leukemia-2)家族中的Bax、Bak、Bad等；Ced3和Ced4存在于线虫中，能引起细胞凋亡；ICE存在于哺乳动物细胞中，是Ced3的同源物，能催化白介素．1p活化，过量表达ICE能引起细胞凋亡；Fas是一种糖基化的跨膜蛋白，是细胞表面受体，也就是Fas抗原(CD95)，Fas配体(Fasligand，FasL)是肿瘤坏死因子家族的一种细胞表面分子，FasL与其受体Fas结合可诱导细胞凋亡。(2)抑制细胞凋亡基因：Ced9，Bcl．2家族中的Bcl-2，Bcl-xL，Bcl．W等，Bcl．2与Bax结合形成二聚体，从而抑制Bax促进的细胞凋亡。(3)凋亡相关基因：包括p53、c-myc，c．fos，c-jun等，p53为抑癌基因，野生型p53能够促进细胞凋亡，p53基因突变失活后能够抑制细胞凋亡。c-myc为原癌基因，编码一种不稳定、高度保守的磷酸蛋白，该蛋白定位于核内，与DNA和非组蛋白结合，能够促进细胞增殖或启动细胞凋亡。在生长因子存在下，促进细胞增殖，无生长因子时，则加速细胞凋亡。1．2．3细胞凋亡的信号通路细胞凋亡的信号通路包括线粒体通路，内质网通路和死亡受体通路，这三个通路不是独立存在的，而是密切联系的。1．2．3．1线粒体通路7 河北农业大学硕士学位(毕业)论文线粒体通路是细胞凋亡的一种“内源性途径”，现已广泛接受线粒体通过释放大量的促凋亡蛋白，在调节凋亡通路中起中心作用。含BH3结构域的Bcl-2家族成员接到促凋亡信号后，BH3结构域外露，与松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆的Bax亚家族成员Bax，Bak等相互作用，导致后者寡聚，并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性增加，跨膜电位丢失，释放细胞色素C(Cyte)和促凋亡蛋白【54】。细胞色素C是线粒体中呼吸链的组成部分，同时也是细胞凋亡过程中的关键蛋白质，在ATP／dATP存在的情况下，Cytc与凋亡蛋白酶活化因子(apoptoticprotease．activatingfactor,Apaf-1)形成多聚复合体，通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域(casp觞erecruitmentdomain，CARD)募集细胞质中的Caspase-9前体，使其自我剪切活化并启动C唧舔e级联反应，激活下游的Caspase．3和CaspaSe．7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡【55l。另外，促凋亡蛋白如凋亡诱导因子(apoptosis-inducingfactor，AIF)和核酸内切酶G从线粒体膜间隙释放入胞浆，诱导细胞凋亡。此外，定位于线粒体上的转录因子p53能与Bak、Bax直接相互作用，这种相互作用使Bak与抗凋亡蛋白分离，Bak中的BH3结构域外露，从而处于促凋亡的结构构象【56】。线粒体是细胞能量代谢的中心，细胞凋亡过程中，线粒体损伤最直接的结果是其正常功能的丧失。线粒体功能障碍不仅会导致自由基产生增加、兴奋性氨基酸释放增多、钙离子超载而引起细胞凋亡外，还能直接诱导细胞凋亡。在此过程中线粒体的能量储备起决定性的作用，如果损伤程度相对较轻，保留的ATP提供细胞凋亡所需的能量，则发生细胞凋亡；若损伤严重，ATP急剧耗竭，则发生细胞坏死。1．2．3．2内质网通路内质网是细胞内Ca2+的主要储存库，也是蛋白质合成的主要场所。内质网在维持细胞内钙离子的稳定及膜蛋白的合成、修饰、折叠和分选等方面都发挥关键性作用【571。内质网介导的凋亡信号转导通路中，CaspaSe．12位于内质网膜，若内质网钙离子平衡的破坏或内质网蛋白的过量积累，一方面会诱导Casp鹊e-12表达，同时也导致胞质中的Caspase-7转移到内质网表面，从而激活Caspa∞．12，激活的CaSp豁e．12可进一步剪切Caspase-3前体，使其活化，而引发细胞凋亡【弱l；另一方面，相对高浓度的ca2+可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶，又可以作用于线粒体，影响其通透性并导致其膜电位的改变，从而促进凋亡。内质网上Bcl．2家族中抑凋亡的蛋白则可以调节网腔中游离ca2+浓度，使胞质中的Ca2+维持在合适的浓度水平，进而起到抗凋亡的作用[59-60]。已有研究证明缺乏CaspaSe．12的小鼠细胞对内质网失常引起的凋亡耐受，但对其他凋亡刺激却仍敏感【61J，说明此过程由内质网失常引起，而不是由以细胞膜或线粒体为靶点的凋亡信号触发。由此可知，Ca2+在凋亡的调节中可能有很重要的作用。1．2．3．3死亡受体通路死亡受体通路是一条由细胞表面死亡受体介导的“外源性途径”；胞外的死亡信号可通过死亡受体转导入胞内。死亡受体是一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因超家族，其胞外部分都含有一个富含半胱氨酸的区域，胞质区有一段由同源氨基酸残基构成的有蛋白水解功能结构，称为“死亡区域”(deathdomain)。“死亡区域”使死亡信号得以进一步传递，而启动凋亡。已知的死亡受体有五种：TNFR-1，Fas，DR3，DR4和DR5。前三种受体相应的配体分别为TNF，FasL(CD95L)，Apo．3L(DR3L)，后两种均为apo．2L。各种死亡受体介导的凋亡通路各有不同。8 犬细小病毒NSI非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究Fas介导凋亡是Fas和FasL识别并结合后，主要经两种途径引发细胞程序性死亡，据此将对Fas介导的细胞凋亡敏感的细胞分为两种：FasI型细胞和FasII型细胞。I型细胞，如胸腺细胞，细胞在接收到经Fas传递的凋亡信号后，胞内区的连接蛋白即Fas相关死亡域蛋白(Fas-associatcddeathdomainprotein，FADD)直接与Fas死亡域结合，FADD激活Caspase-8，引发蛋白水解，导致细胞凋亡【62】；而II型细胞，如肝细胞，通过线粒体使膜通透性增高，细胞色素C释放，进一步与Apaf-I、caspase-9前体、ATP／dATP形成凋亡体(apoptosome)，然后召集并激活caSp笛e-3，导致细胞凋亡【6引。TNF主要在激活的巨噬细胞和T淋巴细胞中表达。TNF与TNFRl结合可激活核转录因子NF-r,B和激活蛋白AP．1，诱导促炎因子和免疫调节因子的表达。TNF介导凋亡与FasL不同的是，TNF只有在蛋白合成被阻断的情况下才可以诱导细胞凋亡，表明细胞中预先存在的一些细胞因子，可以抑制TNF产生的凋亡信号，推测这些抑制蛋白的表达可能是由NF-r,B和Ⅲlc∽心．1调控的科】。TNF与TNFRl结合可诱导受体死亡结构域的聚集，TRADD(TNFR-associateddeathdomam)通过自身的死亡结构域与聚集的TNFRI死亡结构域结合。TRADD可招募RIP(receptor-interactingprotein)、TRAF2(TNFR2associatedfactor)和FADD几种信号分子与激活受体结合，而形成受体复合物。RIP和TRAF2可以激活NF—gB和JNK／AP21【651。在这些蛋白中，只有RIP具有酶活性，但是RIP在NF．r．B和扑ⅨP／AP．1的激活过程中的作用尚不清楚。TRAF2和RIP激活NIK(NF柚mducmgkinase)，后者进而激活IKK(I．r,Bkinase)[65j，然后IKK催化I—心磷酸化，导致I-r．B降解失活，使NF-w．B进入核内，激活转录。级联反应MEKK-1，JHKK和ⅢK参与了从RIP和TRAF2到JNK的信号通路。FADD连接TRADD-TNFRl复合物，激活Caspase．8，从而诱导细胞凋亡。FADD基因敲除小鼠的细胞对TNF诱导的细胞凋亡产生完全的抗性，表明Ⅳ圆D在这条信号通路中起着至关重要的作用。DR3的氨基酸序列与THFRl高度同源断】，并且DR3也可引起与TNFRl类似的NF-r,B激活和细胞凋亡反应。DR3通过RIP、TRAF2和TRADD激活NF-_：B，也可通过FADD、TRADD和Caspase．8诱导细胞凋亡【”1。DR3也可与TNF高度同源的Ap03L结合，Ap03L激活NF-KB和诱导细胞凋亡的调节机制类似于TNF。然而，这些配体和受体的表达有明显的不同：TNF主要在激活的巨噬细胞和淋巴细胞中表达，而Ap03L在许多正常组织中表达脚J；相反，TNFRl在各种组织中广泛表达，而DR3主要在脾、胸腺和激活的T淋巴细胞中表达m】。因此，尽管信号传导途径类似，但TNF-TNFRl和Ap03L-DR3可能具有不同的生物学功能。DR4和DR5的配体都是Ap02L，并且研究发现FADD缺陷的细胞可耐受由Fas诱导的细胞凋亡，但并不能阻断由Ap02L诱导的凋亡，推测FADD非依赖性凋亡途径可能与Apo-L到Caspase有关【671。死亡配体与死亡受体结合后，激活无活性的pro-easpase．8，激活的Caspase-8不仅可激活下游效应C鹳p弱e，裂解多种蛋白质而最终导致细胞凋亡，同时还可以降低线粒体内膜电位，使Bcl．2家族成员裂解，导致Cytc的释放【鹋】，Cytc与Apaf-1结合，在dATP的存在下活化Caspase．9，启动Caspase级联效应，诱导细胞凋亡。1．3研究目的和意义9 河北农业大学硕士学位(毕业)论文犬细小病毒病是一种急性的接触性传染病。犬细小病毒是DNA病毒中属于高度变异的一个病毒，它对环境的耐受能力较强、传播速度迅速、对幼犬的致病性和致死率高，因此在世界范围内给养犬业带来了巨大的灾难。目前，国内外已有研究对犬细小病毒致病机理的相关报道甚少。Bauder等【69】研究证实在体内CPV感染可诱导肠粘膜上皮细胞的凋亡和坏死，进而引起继发感染。基于上述理论，本研究探索CPV感染引起的细胞凋亡是否由犬细小病毒NSl蛋白所诱导，初步探讨犬细小病毒致病的分子机理。本研究通过把犬细小病毒基因组中NSl基因克隆入pcDNA3．1A质粒构建出NSl真核表达载体，并转染HEK293FT细胞瞬时表达NSI重组蛋白，从而研究NSl蛋白对F81宿主细胞凋亡的影响。本研究在细胞水平上研究犬细小病毒NSI蛋白对宿主细胞凋亡的影响，为进一步研究犬细小病毒致病的分子机理奠定基础，从而促进开发出有效的疫苗或者治疗药物。10 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究2实验一犬细小病毒非结构蛋白NSl基因的克隆及在．瑚三K293FT细胞中的表达2．1材料2．1．1载体、菌株和细胞株pEasy-BluntCloningVector载体购自北京全式金生物技术有限公司；pcDNA3．1A真核表达载体购自美国Invitrogen公司；大肠杆菌DH5a购自美国Invitrogen公司；人胚肾细胞HEK293FT由中国科学院微生物所惠赠；犬细小病毒CPV．2a型毒株【70】由中国农业大学刘维全博士惠赠。2．1．2主要试剂2．1．2．1普通试剂Na2C03、NaCl、NaOH、NaHC03、NaAc、Na2HP04·12H20、HCI、LiCl、CaCh、MgCh、KCl、KH2P04、甘油、氨苄青霉素、冰乙酸、醋酸铵、苯酚、甲醇、无水乙醇、异戊醇、异丙醇、丙酮、葡萄糖、乙酸钾、二甲苯青FF、蔗糖、溴酚兰、氯仿、明胶等为化学纯、分析纯试剂，国内各大试剂公司生产。细菌培养用胰蛋白胨(Tryptone)和细菌培养用酵母提取物(YeastExtrac0购自英国Oxoid公司；琼脂(Agar)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，EDTA，蛋白酶K，RNaseA，二甲基亚砜(DMSO)，甘氨酸，十二烷基硫酸钠(SDS)，丙烯酰胺(A呻，N，N’．亚甲双丙烯酰胺(Bis)，巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)，过硫酸氨(AP)，Tween．20，溴酚蓝均为德I蒌ISigma公司产品；N，N，N’N'-四甲基7．--胺(TEMED)，DMEM培养基，胰蛋白酶(trypsinase)，胎牛血清为美国GIBCO公司产品；WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem试剂盒均购自美mPromega公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司；Glucose为美国Fluka公司产品；0．2nnl硝酸纤维素膜(NCmembrane)，预染蛋白分子量Marker为美国Bio-RadLaboratories公司产品："Iris饱和酚为北京索莱宝科技有限公司产品；鼠抗His多克隆抗体购自SantaCruzBiotechnology公司；碱性磷酸酶标记兔抗鼠IgG抗体购I刍VectorLaboratories公司。2．1．2．2工具酶限制性内切酶BamHI、AgeI，T4DNA连接酶、均购自美国Promega公司；TransStartFastPfuDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。2．1．3试验所用溶液及其配制2．1．3．1抗生素类氨苄青霉素贮存液(100mg／mL)：O．5g氨苄青霉素溶于5mL重蒸水中，用0．22“m微孔滤膜过滤除菌，分装，一20"C保存。 河北农业大学硕士学位(毕业)论文2．1．3．2病毒基因组DNA提取所用试剂(1)Hirt细胞裂解缓冲液：10MmEDTA、0．6％SDS、100u咖L蛋白酶K(现用现配)；(2)5MNaCI：称取29．229NaCI溶于100mL蒸馏水中。2．1．3．3大肠杆菌感受态细胞制备及转化所用试剂(1)LB液体培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCI10g，加蒸馏水至900--950mL，用NaOH调pH至7．4，定容到1000mL，高压灭菌20min。(2)LB固体培养基：100mLLB液体培养基中加入琼脂粉1．5g，高压灭菌20rain，取出冷却到50℃左右，倒入灭菌的培养皿中。(3)LB氨苄青霉素固体培养基：取200mLLB培养基，加入3g琼脂粉，高压灭菌20mill，取出冷却到50℃左右，加入200gL氨苄青霉素贮存液(100mg／mL)混匀倒入灭菌的培养皿中·(4)0．2mol／LHCI：16．8mL浓盐酸加蒸馏水定容到1000mL。(5)10mmol／LTris-HCl：用0．1mol／LTris．HCI(pH8．0)稀释10倍。(6)75mmol／LCaCl2溶液：10mmol／LTris．HCl，75mmol／LCaCl2，调pH6．5，高压灭菌(取2．06gCaCl2溶于250mL10mmol／L“s-HCl中，用0．2mol／LHCI调pH为6．5)。(7)CaCl2甘油溶液：42．5mL75mmol／LCaCl2，加入7．5mL甘油，高压灭菌。2．1．3．4质粒DNA提取所用试剂(1)SolutionI：25mmol／LTris．HCl(pH8．0)，50mmol／L葡萄糖，10mmol／LEDTA(r,I-18．O)，高压灭菌。(2)SolutionII(新鲜配制)：0．2mol／LNaoH：I％SDS。(3)SolutionlII：5mol／LHAc，3mol／LKAc，高压灭菌。(4)O．1mol／L嘶s．HCl0H8．0)-确s3．03g溶于220mL蒸馏水中，用浓HCl调节pH至8．0，定容至250mL，高压灭菌后室温保存。(5)0．5mol／LEDTA(pi-i8．O)：18．61gNa2EDTA．2H20溶于80mL蒸馏水中，用NaOH调节硼至8．0，定容至100mL，高压灭菌后室温保存。(6)3moFLNaAc(pI-15．2)-24．6gNaAc溶于90mL蒸馏水中，加3mol／LHAc调pH为5．2，定容至100mL。(7)70％乙醇(v，v)：用重蒸水和未开封的无水乙醇按比例配制成浓度为70％的乙醇，412贮存备用。(8)RNaseA(10mg／mL)：10mgRNaseA溶于1mLTE(pH8．0)溶液中，100*C煮沸10min，分装于0．5mL离心管中，-20℃保存。(9)TE缓冲液(pH8．0)：1mmol／LEDTA，10mmol／LTris-HCl，高压灭菌。2．1．3．5琼脂糖凝胶电泳所用试剂(1)6xDNA上样缓冲液：0．25％-二甲苯青FF，0．25％溴酚兰，40％(w／v)蔗糖(取O．125g溴酚蓝和209蔗糖，溶解定容至50mL即可)。(2)10mg／mL溴化乙锭(EB)：在100mL蒸馏水中加入1g溴化乙锭，立即剧烈搅拌至完全溶解，将溶液转移至棕色瓶中，4℃避光保存。 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究(3)50xTAE：冰乙酸57．1mL，Tris242g，0．5MEDTA(pH8．0)100mL，加水至1000mL。2．1．3．6SDS．PAGE的所用试剂(1)lmol／LHs．HCl缓冲液(pH6．8)：瓢s12．1g加入去离子水中使之溶解，再加入lmol／LHCI溶液调pH至6．8，最后加去离子水定容至100mL。(2)lmoI／L而s．HCI缓冲液(pH8，8)；陆24．29加入去离子水中使之溶解，再加入1mol／LHCI溶液调pH至8．8，最后加去离子水定容至200mL。(3)30％(WⅣ)丙烯酰胺溶液：丙稀酰胺(A哪30g、双丙烯酰胺(Bis)0．8g，100mL去离子水溶解，过滤，放于棕色瓶中，于4。C储存，1个月内可使用。(4)10％(WⅣ)SDS：lgSDS溶于10mL去离子水中。(5)10x电极缓冲液(pH8．3)：Tris30．3g、甘氨酸144．2g、SDS10g，溶于去离子水并定容至1000mL，使用时10倍稀释。(6)2x样品稀释液：3mL甘油、lmL巯基乙醇,500mgSDS、4mg溴酚蓝、2mLImol／LpH6．8Tris-HCl缓冲液，无离子水定容至10mL，．20℃贮存。(7)10％(W～)过硫酸铵(AP)溶液：lgAP溶于10mL无离子水中(要求现用现配)。2．1．3．7Western-blot所用试剂(1)膜转移缓冲液：嘶s3．025g，甘氨酸14．4lg，甲醇200mL，用蒸馏水定容至1000mL，溶解后室温保存，可以重复使用3～5次。(2)TBS缓冲液：NaCl8．8g，1mol／L％s-HCl(pH7．5)10mL，用蒸馏水定容至1000mL。(3)TBST缓冲液：含O．05％Tween．20的TBS缓冲液。(4)封闭液：含5％脱脂奶粉的TBST。(5)封闭液配制的一抗：在TBST配制的5％脱脂奶粉中加入鼠抗His多克隆抗体，稀释倍数为1：500。(6)AP标记的二抗：在TBST配制的5％脱脂奶粉中加入碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG抗体，稀释倍数为l：1000。2．1．3．8细胞表达所用试剂(1)PBS(pn7．4)：Na2HP04·12H202．9g、KCl0．2g、KH2P040．2g、NaCI8g，加蒸馏水至1000mL，高压灭菌。(2)胰蛋白酶贮存液(10x)：NaHC030．58g，NaCl2．0g，KCl0．4g，葡萄糖1．Og，Na2EDTAO．2g，胰蛋白酶0．6g，酚红O．02g，用重蒸水100mL溶解，过滤除菌，分装，-2012保存，避免反复冻融(或者0．6g胰蛋白酶用10mLPBS溶液解)。(3)双抗贮存液(100x)：氨苄青霉素盐100万单位，链霉素100万单位，加重蒸馏水至100mL，过滤除菌，分装，-20℃保存。(4)谷氨酰胺(Gin)贮存液(100x)：谷氨酰胺3g，加重蒸馏水100mL溶解，过滤除菌，分装，．20"C保存。(5)DMEM培养基(DulbeccosModifiedEagleMedium)：l升量粉剂，加入3．7gNaHC03，加约900mL重蒸水，调pH至7．15，定容到1000mL，过滤除菌。13 河北农业大学硕士学位(毕业)论文(6)细胞培养应用液细胞生长液：·DMEM+双抗+Gln+lO％新生牛血清细胞维持液：DⅧM圾抗+Gln+5％新生牛血清细胞复苏液：DMEM+双抗+Ghl+15％新生牛血清细胞冻存液：60％DMEM+10％二甲亚砜+30％新生牛血清(7)2xHBS：NaCl16．36g，Na2HP04．12H200．2684g，KCl0．7456g，Glucose2．16g，HEPES11．92g，加重蒸水500mL溶解，过滤除菌，．20℃保存。(8)2．5mol／LCaCh：取CaCl269．37g，溶于250mL重蒸馏水中，过滤除菌，4"C保存。(9)表达培养基：10mgBSA，溶于100mLDMEM(含双抗和Gin)，过滤除菌，4"12保存。2．1．3．9非变性条件下裂解细胞所用试剂非变性细胞裂解液：主要成分为5mMTris．HCl，25mMKCI，2mMEGTA，2mMEDTA，1％NP-40，置于．20"C冰箱保存；使用前添加150mMNaCI，lmMleupeptin，1mMPMSF，100raMaprotinin，避免反复冻融，4℃避光保存。2．1．4主要仪器50mL离心机，高速台式离心机(TG【广16B型)为上海安亭仪器厂；FA2004型电子天平为上海精科实业有限公司；ATC201型PCR仪为美国阿波罗公司产品；．80℃低温冰箱购自美国ThermoForma公司；．20℃冰箱为青岛海尔股份有限公司；超净工作台为北京东联哈尔仪器制造有限公司；LS．B35L型立式压力蒸汽灭菌锅为江阴滨江医疗设备厂：三用电热恒温水箱购自北京长安科学仪器厂；DYCP．31A型电泳槽，电泳仪为北京市六一仪器厂；10l型电热鼓风干燥箱，DH6000AB型电热恒温培养箱为天津市泰斯特仪器有限公司；MCO．15AC型C02恒温培养箱为日本SANYO公司；低速离心机为北京医用离心机厂；倒置显微镜购自重庆光电仪器总公司；自动双重纯水蒸馏器，自动三重纯水蒸馏器为上海亚荣生化仪器厂；DELTA320型pH计为梅特勒．托利多仪器(上海)有限公司；TRANS．BLOTRSDSEMI-DRYTRANSFERCELL，凝胶自动成像系统，半干式转移电泳装置均购自美国Bio．Rad公司；SIM．F124型制冰机为日本三洋公司；移液器为大龙医药设备(上海)有限公司；HQ．60型旋涡混合器为北京同正生物技术发展公司；CX31荧光显微镜为日本Olympus公司产品；BPCL．L微弱发光测量仪为中国科学院生物物理所研究产品。2．2方法2．2．1病毒基因组DNA的提取：采用Hirt法【7l】(1)在T25细胞瓶中培养F81细胞，细胞传代后，接入500儿CPV病毒液，置于37。C，5％C02培养箱培养。(2)36h后，F81细胞80％发生收缩，吸去培养基，PBS洗涤2次，JJn／k800I．tL新鲜配制的Hirt细胞裂解缓冲液，37"C作用1h后，补加200此5MNaCI颠倒混匀，冰浴lh，12000g14 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究离心30mill。(3)慢慢吸取上清至新1．5mL离心管中，用等体积的酚，酚／氯仿分别抽提上清液一次，以除去上清中的蛋白酶K，12000rpm离心10rain，取上清。(4)用2倍体积的无水乙醇，1／10体积的3MNaAe(PH5．2)，4"12条件下沉淀病毒DNA(一般过夜)。12000rpm4"C离心10rain，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀一次，待乙醇完全挥发后将其溶解于20皿TE(含10ug／mlRnaseA)中。病毒基因组DNA已制备完毕，待PCR鉴定。2．2．2犬细小病毒NSl基因的扩增2．2．2．1PCR引物的设计与合成参考GenBank已发表的犬细小病毒非结构蛋白NSI基因的序列(No．M-19296)，设计2对引物用于扩增犬细小病毒NSl基因(表1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1扩增犬细小病毒NSI基因的引物Table1PrimersforamplificationofCPVNSIgenePrimersSequenceofprimers(5L}3’)Siz酬,pRestrictionsitesNSl．FCGCGGATCCAC2030BamHINSl．RCGC_℃ACCGGAgelNSl．FCGCGGATCCAC2027BarnHINSl／MH．RCGC℃ACCGGAgelThe$1ZI笛oftheamplifiedPCRproductsincludethecorrespondingprimers．Theitalicandunderlinedlettersindicaterestrictionsites．TheshadowedlettersrepresentthecomplementarysequencesagainstthetemplateDNA．鉴于实验室目前缺少犬细小病毒NSl蛋白的特异性抗体，在下游引物NSl／MH．R设计时去除犬细小病毒NSl基因的终止密码子，这样可将犬细小病毒NSl基因与pcDNA3．1A载体上的His标签融合，构建peDNA3．1-NSl／His真核表达载体，便于表达产物的鉴定。另一个下游引物NSl．R中包含终止密码子，用于构建与His标签非融合真核表达载体pcDNA3．1-NSl，以减少His标签对本实验的干扰。2．2．2．2PCR扩增NSl基因以病毒基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增犬细小病毒NSl基因。PCR的反应体系如下：10xPCRBufferdNTPs(25mmol／L)上游引物(25pmol／mL)下游引物(25pmol／mL)模板DNA(300ng／mL)ddH20FastPfuDNA聚合酶(5U／“L)5gL2．5此1gL1¨L3laL36．5gL1儿总体积50此混匀，瞬时离心。PCR反应条件为：94"C预变性5min，然后在94℃变性lmin，58℃复性115 河北农业大学硕士学位(毕业)论文min，72。C延伸2rain的条件下，循环30次，最后在72℃延伸10min。PCR产物经l％的琼脂糖电泳鉴定。2．2．2．3PCR产物的电泳鉴定(1)l％琼脂糖凝胶的配制：将凝胶平板两端用胶带封闭，放好样孔梳，梳齿的位置在平板底面上(O．5～1．0)rilln；然后称取500mg琼脂糖，置于一锥形瓶中，加入50mL的电泳缓冲液(1xTAE)，在微波炉中加热融化，平稳旋转摇晃使之均匀混合。待融化的琼脂糖冷却至55"C，再加入5旺溴化乙锭溶液(10mg／mL)，使其终浓度为0．5肛g／mL，立即轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液，将琼脂糖浇灌到平板。倒入融化的琼脂糖时，需保证在梳子的下方不留气泡，凝胶表面的气泡必须在凝胶凝固之前排除。室温静置45min，待凝胶溶液完全凝结，从凝胶平板上取下样孔梳，小心不要撕裂样品孔。将装有凝胶的平板放入电泳槽中，加入足量的电泳缓冲液，覆盖并超过凝胶约lmill或刚好浸及整个样孔，保证样孔中没有气泡；(2)加样：取0．3此6×上样缓冲液与5gLPCR产物混合，用微量移液枪反复吹吸混匀，再将混合液点到凝胶孔中，在样品孔的一侧孔内点取适当的DNA相对分子质量标志物(Maxker)，以便比对；(3)电泳：正确连接导线，由于DNA带有负电子，在凝胶中向阳极(红色插头)侧泳动，所以点样孔在阴极侧。将电压设定需要的强度，一般是100V，将凝胶装置加盖，开始电泳。阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入凝胶内。当上样缓冲液中的溴酚蓝颜料迁移至凝胶的2／3处时，关闭电源，拔出电极插头，打开电泳槽盖。(4)观察结果：小心取出凝胶，放入紫外检测仪中观察结果。2．2．3犬细小病毒NSl基因的克隆2．2．3．1PCR产物的回收与纯化PCR产物经1％琼脂糖电泳分离和纯化后，切下目的条带，随后按照天根生物技术有限公司胶回收试剂盒使用说明进行回收，并对回收产物进行电泳鉴定。具体操作步骤如下：(1)配制l％的琼脂糖凝胶，然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。(2)PCR产物经鉴定符合预期大小后，在紫外灯下切取含有PCR产物的小块凝胶，此时应注意尽量切除不含目的片段的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。用电子天平称取其重量。注意：切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。(3)柱平衡步骤：把吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500gL平衡液，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。(4)按照100mg胶块加300mL溶胶液的比例，向胶块中加入3倍体积溶胶液。50。C放置10min，其间每隔2min温和地上下翻转Eppendoff管，使胶完全溶化。(5)将上一步所得溶液加入步骤(3)中平衡的吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心30---60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。(6)向(5)中吸附柱加入700pL漂洗液，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，16 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究将吸附柱放回收集管中。(7)向(6)中吸附柱加入500此漂洗液，12000rpm离心30—60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。(8)为了除尽漂洗液，12000Ipm离心2rain，将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，彻底的风干，以防止残留的漂洗液影响下一步的试验。(9)将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70。C水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置2rain，然后12000rpm离心2min，收集所得液体即含有目标DNA片段，．20℃保存。2．2．3．2NS1基因和pEasy-BluntCloningVector的连接经纯化并回收的NSl基因与载体按下列顺序，在0．5mLEp管中依次加入，建立5此的连接体系。NSl基因片段4此pEasy-BluntCloningVector1此5“L瞬时离心，室温连接15rain，反应结束后置于冰中，待下一步转化。2．2．3．3连接产物转化宿主菌(一)大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备为了把重组质粒转入大肠杆菌进行扩增，就必须制备能够吸纳外源DNA分子的感受态细胞。细菌处于容易吸纳外源DNA的状态称为感受态。用冷的CaCl2对大肠杆菌进行处理，可以提高膜的通透性，从而使大肠杆菌易于吸收外源DNA。下面是制备感受态细胞的具体步骤：(1)把冻存的大肠杆菌DH5a从．80"C冰箱取出，用接种环沾取少量菌种，用划线法轻轻接种于不含抗生素的LB固体培养基培养板上，置于37℃温箱中倒置培养过夜。(2)挑取单个菌落，接种于6mL不含抗生素的LB液体培养基，置于摇床中，37"(2180rpm振荡培养过夜(16～18h)。(3)取0．5mL菌液接种于50mL不含抗生素的LB液体培养基中，37。C振荡培养3h左右，至oD600值为0．4左右。(4)冰浴10min，在4"C无菌条件下，6000r／rain，离心10min。(5)弃去上清，在沉淀中加入20mL预冷的75mmol／LCaCl2溶液，振荡悬浮后冰浴20rain。(6)在4"C下，4000r／rain，离心5min，使菌体沉淀；弃上清，将细胞悬浮于3mL预冷CaCl2甘油溶液中。在超净工作台中用灭菌的1．5mL离心管分装，每管200pL，．80"(2保存，半年以内有效。(二)重组质粒的转化(1)取5此连接液，加入200pL感受态细胞中，轻轻震荡混匀，切勿用移液枪吹打，冰浴40min。(2)将转化管置于42℃水浴中热冲击90s。(3)迅速将转化管冰浴10min，加入500此37"C预热的LB培养基，37"C振荡培养lh，复苏细菌，使抗生素抗性基因表达。17 河北农业大学硕士学位(毕业)论文(4)室温下，3000rpm离心5min，弃去500laL上清，用剩余2009LLB重悬细菌。(5)加入IPTG(异丙基硫代．p．D．半乳糖苷)和X．gal(5．溴4．氯．3．吲哚．p．D半乳糖苷)各lO此，轻轻混匀，将菌液转移至Amp+琼脂平板上，用无菌玻璃涂布器均匀涂布于平板表面，室温放置20--30min，待菌液被吸收后，将平板置于37℃培养箱中，倒置培养12-16h。(6)观察菌落生长状况，以挑取阳性重组子。2．2．3．4重组质粒的阳性筛选(一)重组质粒的提取(1)挑取lO个白色菌落，分别将其接种到盛有6mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37。C摇床培养过夜。(2)取上述培养液1．5mL于1．5mLEp管中，6000r／min离心，弃上清，重复三次。(3)在菌体沉淀中加入100laL预冷的SolutionI，vortex混合，使其重新悬浮，再加入200gLSolutionII，上下颠倒混合，冰浴5min。加入150／aL预冷的SolutionIII，轻轻地倒转混匀，冰浴10min。(4)在室温下，12000r／rain离心10min，取上清液于另一1．5mLEp管中，分别用等体积的酚(％s饱和酚)、酚／氯仿抽提一次，取上清液于另一离心管中。(5)在上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积3mol／LNaAc，室温放置30rain，12000r／min离心10min，弃上清液，70％乙醇洗涤沉淀一次，风干，溶于3mLTE(pn8．0)中。(6)加入lgLRNaseA，37℃消化30min，以去除核酸内的RNA；然后质粒溶液置于．20。C保存。(二)重组质粒的酶切鉴定根据引物设计的酶切位点，用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定。反应体系(109L反应体系)质粒3此Age10．5IlLBamH10．5此10xBuffer1gL无菌去离子水5儿lO¨L混匀，瞬时离心后，37℃酶切4h，用l％的琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。(三)序列测定与分析为了进一步证实NSl基因是否正确插入到载体中，并分析读码框架是否正确，将酶切鉴定正确的的阳性质粒送上海生工生物工程公司进行序列测定，并与基因库中的序列进行比对。测序正确的重组质粒命名为pEasy-NSl和pEasy-NSl／I-Iis。2．2．4NSl基因真核表达载体的构建2．2．4．1克隆质粒和pcDNA3．1A载体质粒的酶切克隆质粒的酶切体系如下：18 犬细小病毒NSI非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究pEasy-NSl12此BamHI1此AgeI1皿10xBuffer3旺塑2Q!唑20此载体质粒的酶切体系如下：I∞DNA3．IA10此BamHI1皿AgeI1IlL10xBuffer2此ddH206皿20灿混匀，瞬时离心后，在37"C酶切4h，用l％的琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。通过胶回收试剂盒纯化并回收两片段。2．2．4．2NSl基因与表达载体的连接、转化及鉴定NSl基因5“LpcDNA3．1A1此T4DNA连接酶l皿10×T4DNA连接酶1此螋2Q呈唑10此瞬时离心，16。C过夜连接。NSl基因与表达载体的连接体系转化至DH5a感受态细胞中，涂布于LB氨苄固体平板上培养过夜，挑取单个菌落，接种于LB氨苄液体培养基中培养12—16h，然后提取质粒，经双酶切鉴定为正确的阳性质粒送上海生工生物工程公司进行序列测定，并与基因库中的序列进行比对。测序正确的重组质粒命名为I∞DNA-NSl和pcDNAoNSl／His。2．2．5重组NSl蛋白的表达与鉴定2．2．5．1人胚肾细胞HEK293FT细胞的复苏、培养及冻存细胞的复苏：从液氮保存罐中取出冻存细胞，立即放入37。C恒温水浴箱内，快速摇晃，直至冻存液完全融化，然后将细胞悬浮液移入15mL离心管，缓慢加入5mL细胞复苏液，800rpm，离心5min，用细胞复苏液重悬细胞，调整细胞浓度，置于T25细胞培养瓶中，在37℃，5％C02细胞培养箱内培养，待细胞贴壁后，换细胞生长液。细胞的培养：细胞悬浮液用细胞计数板计数后，用培养液将细胞数调整为3×105cells／mL，分装于细胞瓶中，使细胞悬浮液略高于培养瓶底部为宜，置于37。C，5％C02细胞培养箱静置培养24h~36h，换细胞生长液，培养36h~72h后，细胞可以粘附于瓶底，并开始伸展生长。在细胞培养过程中，主要视细胞生长状况确定换液和传代的时间。若细胞生长过快，可更换细胞维持液19 河北农业大学硕士学位(毕业)论文或降低生长液中的血清浓度；若细胞生长过慢，可提高生长液中的血清浓度。细胞的传代：细胞长满后，吸去或倒掉细胞瓶中旧培养液，用PBS洗细胞2次，然后加入l×胰蛋白酶，置于细胞培养箱进行消化，视细胞消化程度确定消化时间，一般在2~5min。在倒置显微镜下观察，当细胞回缩，细胞间隙增大后，并且部分细胞出现脱落现象，轻轻拍打细胞瓶，使细胞脱离瓶壁。加入细胞生长液终止消化，用吸管轻柔吹打数次使细胞彼此分开，用计数板计数后，分装于新细胞瓶中，置于37"C，5％C02细胞培养箱中培养。细胞的冻存：选取对数生长期的细胞，移去细胞瓶中的生长培养基，用PBS洗细胞2次，用l×胰蛋白酶消化细胞，加入细胞生长液使细胞悬浮，转入15mL离心管，500r／min离心5min，弃上清。将离心管置于冰浴中，慢慢滴加预冷的细胞冻存液，边加边缓慢摇晃，使细胞悬浮和分散，视细胞密度大小调整加入的冻存液量(一般T25培养瓶中的细胞加入2~3mL冻存液)，将细胞悬液分装于无菌细胞冻存管，每管加1～1．5mL细胞悬浮液，拧紧瓶盖，做好标记。把冻存管置于4。C冰箱30min，然后-20℃冰箱4h，然后放入一70℃冰箱12h，梯度降温后移入液氮保存罐中(操作时应戴手套，以免液氮冻伤)。2．2．5．2人胚肾细胞HEK293FT细胞的磷酸钙转染(1)准备细胞：转染前一天传代HEK293T细胞于”5细胞瓶，待细胞满度为80％时进行转染。(2)制备磷酸t铲J--DNA沉淀：取15mL无菌离心管，加入1．4mL2xHBS，再缓慢加入30--60ggDNA，加无菌水至2．66mL，混匀；然后慢慢加入140gL2．5moFLCaCl2，vertex5S，室温30min，使其形成磷酸钙—渊A悬浮液。(3)转染：更换细胞培养基为4mL不含双抗的细胞维持液，然后将预先制备好的2．8mL磷酸93--DNA复合物加在HEK293T单层细胞表面(可以观察到培养基瞬间变成橘黄色，应立即轻轻摇动混匀，避免形成大颗粒，影响转染效率)。(4)转染6h后，吸去培养基与DNA沉淀，加入10mL37。C预热的细胞生长液培养。(5)转染16--7211后，观察细胞状态，待细胞状态欠佳时弃培养基，用PBS洗细胞2次，收集细胞，待下一步裂解细胞收集NSl蛋白。(6)同时用空载体I)cDNA3．IA转染HEK293T细胞作为阴性对照。2．2．5．3非变性条件裂解细胞(1)制备非变性细胞裂解液：取适量细胞裂解液，使用前加入150mMNaCI，lmMleupeptin，lmMPMSF，100mMaprotinin，混匀，置于冰盒中预冷。(2)收集细胞：弃去培养基，用PBS洗涤两次，把细胞收集于15mL管中，500rpm，离心5min收集细胞。(3)裂解细胞：按照每个T25细胞瓶加入600“L～lmL的比例加入非变性细胞裂解液，用手指轻弹以充分混匀细胞，促进细胞充分裂解，冰浴1h后，12000rpm，离心20min，取上清，即可进行后续SDS．PAGE电泳。2．2．5．4SDS．PAGE电泳(1)安装垂直板电泳槽。20 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究(2)制备SDS．聚丙烯酰胺凝胶：根据需要配置的分离胶和浓缩胶浓度和体积来制备凝胶。①制备分离胶：从冰箱取出制胶试剂，应平衡至室温。成分加入体积30％丙烯酰胺(IIlL)1．67mL1．5MpH8．8Tris．HCI缓冲液(mL)1．25mL无离子水(mL)2mL10％SDS(mL)0．05mL10％AP(mL)0．025mLTEMED(山5此混匀后，将配好的分离胶用移液器立即加入两块玻璃板的间隙中(尽量避免产生气泡)，至胶面离玻璃板凹槽3．5cln左右，然后在胶面上轻轻铺上1tin高的蒸馏水水，加水时要慢，勿扰乱胶面。室温放置20-30min左右使其聚合，直至可见凝胶与水之间有一清晰界面。倾去水封层的蒸馏水，然后用没有毛边的滤纸条吸去多余水分。②配浓缩胶成分加入体积30％丙烯酰胺(mL)0．325mL0．5mol／LpH6．8Tris．HCI缓冲液(mL)0．625mL无离子水(mL)1．53mL10％SDS(mL)0．025mLlO％AP(mL)0．025mLTEMED(斗L)5此混匀上述溶液，用少量灌入玻璃板间隙中，冲洗后弃去，再把余下的胶液注入间隙，使胶液面与玻璃板凹槽处平齐，插入Telfon齿梳，室温聚合lh左右。待胶凝固后，拔出Telfon齿梳，加入电极缓冲液(淹没胶，但不高于电泳槽)。(3)上样：取非变性条件下的细胞裂解液lO此，加入10此2×样品稀释液，混匀，于沸水中煮沸3～5min。将处理好的样品加入到凝胶孔中，同时加一道预染蛋白质Marker，连接电泳仪。(4)电泳：打开电源，调整电源恒压为100V，电流20mA开始电泳，待样品全部进入分离胶后，将电压调至120V，电流25mA继续电泳，待指示剂(溴酚兰)距凝胶的底部lcm时停止电泳，取下玻璃板小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来，取出分离胶。2．2．5．5Western．blot分析表达产物按照BIO．RADMiniTrans-blot半干转印仪操作说明书进行如下步骤：(1)转印前的准备工作：割取带有蛋白样品和预染Marker的凝胶，剪取与凝胶大小一致的硝酸纤维素膜(NC膜)，并在右上角做好标记，同时将凝胶、海绵与硝酸纤维素膜一起浸泡在转印缓冲液中。(2)蛋白质转印的操作步骤：在水平桌面上依次铺上海绵、硝酸纤维素膜、凝胶、海绵，做成“三明治”，用玻璃棒赶去凝胶与硝酸纤维素膜之间的气泡，然后将“三明治”放入电转移装置中，凝胶在阴极端，硝酸纤维素膜在阳极端，组装好电转移装置。打开电源，调到20V，20min，21 河北农业大学硕士学位(毕业)论文开始电转。转印结束后关闭电源，打开装置，取出硝酸纤维素膜和凝胶，弃去凝胶，擦干电转装置，冲洗海绵。(3)封闭：取出硝酸纤维素膜，放入用TBST配制的5％脱脂奶粉的封闭液中，4℃封闭过夜。(4)一抗杂交：加入l：500稀释的鼠抗His多克隆抗体，置于37℃摇床上杂交2h。用lxTBST漂洗硝酸纤维素膜3次，每次3min。(5)二抗杂交：加入l"1000稀释的碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG，置于37℃摇床上杂交2h。用IxTBST漂洗硝酸纤维素膜3次，每次3min。(6)显色：最后取2mL显色液(NBT／BCIP)，滴在放在保鲜膜上的硝酸纤维素膜上(需避光)，放置约3～5min；待出现明显紫色带时，加入PBS或蒸馏水终止反应。(7)根据在膜上的显色带来判断结果，然后用扫描仪记录显色结果。2．3结果与分析2．3．1犬细小病毒NSl基因的扩增扩增犬细小病毒后，采用Hirt法提取病毒基因组，由图2．1A可见，犬细小病毒基因组大小约为5000bp，与Genbank发布的基因大小一致，然后以犬细小病毒基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增NSl基因，扩增的PCR片段见图2一lB，由图可见，扩增片段约为2000bp，与预期片段大小一致。2000lOOO750500250100AB图2．1犬细小病毒NSl基因的扩增Fig．2-lAmplifiedproductofNSlgeneA．犬细小病毒基困组DNA；B．NSI基因PCR扩增结果A．Genomeofcanineparvovirus；M．DL2000DNAMarker；I．genomeofcanineparvovirus．B．AmplifiedproductofNSIgenebyPCR；M．DL2000DNAMarker；1．NSlgenefragment．2．3．2犬细小病毒NSl基因的克隆22 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究将扩增的NSl基因PCR产物回收后与pEasy-BluntClongingVector连接，构建NSI克隆质粒pEasy-NSl和pEasy．NSl／His。转化DH5a感受态细胞，挑取菌落提取质粒，重组质粒经HindIII酶切鉴定，得1615bp和4300bp的两条带(见图2-2)，与预期结果相符，表明NSl基因成功克隆到载体中。4300bp1615bp200．01000750500250100图2-2NSI基因克隆质粒的酶切鉴定Fig．2-2RestrictionanalysisofNSlgenerecombinantplasmid；M．DL2000DNAMarker；1．pEasy·NSIdigestedbyHindIII．2．3．3NSl基因真核表达载体的构建利用BamHI和AgeI将克隆载体中NSl基因亚克隆入pcDNA3．IA载体上构建NSI真核表达载体pcDNA—NSl／His和pcDNA-NSl(图2．3A)。重组质粒分别用BamHI和AgeI双酶切鉴定均得到约2000bp和5．5kb(载体)的2条DNA片段，2000bp的小片段即为犬细小病毒NSl基因，表明己将其克隆到pcDNA3．1A载体上(图2．3B)。经过测序证明，本试验扩增的NSl基因序列与GenBank发表的序列一致。5kb2000bp20001000500250100AB图2．3NSI真核表达载体的结构及酶切鉴定图谱Fig．2-3StructureandrestrictionanalysisofNSIexpressionvectors．A．NSI真核表达载体的结构图；B．NSI真核表达载体酶切鉴定图谱；A：NSIgeneexpressionvectors．CMV,humancytomegalovirus(CMV)promoter；NSl，non—structuralprotein·Iofcanineparvovirus；His，6xhistidinetag．B：RestrictionanalysisofNSlgeneexpressionvectors．Lane1，pcDNA-NSlmisdigestedbyBamHIandAgeI；Lane2，pcDNA-NS1digestedbyBamHlandAgel；M，DL2000DNAMarker．23 河北农业大学硕士学位(毕业)论文2．3．4NSl基因在HEK293FT细胞中的表达为证明构建的pcDNA-NSl／His真核表达载体能否在真核细胞中进行表达，本研究通过磷酸钙介导将pcDNA-NSl／His和pcDNA3．1A(对照)分别转染HEK293FT细胞，48h后在非变性条件下裂解细胞，通过Western-blot检测细胞中表达的NSI融合蛋白，结果见图2—4。由图2_4可见，在分子质量约70kDa处有l条明显的杂交带，而空载体在相应位置并未见杂交带，这说明NSl基因能够在真核细胞中表达。kDalM2209一镳麟124一《嚷黪t80。捌懿姆十70kDa49．1一豢毒l。2．4讨论CPV是感染犬最简单的病毒之一，CPV编码的结构蛋白和非结构蛋白在病毒的增殖过程中均起重要作用。NSl蛋白是该病毒重要的非结构蛋白，在病毒复制的早期NSl大量表达，研究证实NSl在病毒复制和转录等过程发挥重要作用【72．731。病毒在宿主细胞中大量增殖必定会严重干扰宿主细胞的正常功能，病毒编码的蛋白，特别是非结构蛋白对宿主细胞功能的干扰作用较大。为研究CPVNSl非结构蛋白对细胞凋亡的影响，本实验构建了NSl基因的真核表达载体，通过瞬时转染HEK293FT细胞，研究NSl蛋白能否在真核细胞中表达。由于NSI基因表达载体不含信号肽序列，所以表达的重组NSl蛋白存在于细胞内，与自然感染CPV一样，重组NSl蛋白在宿主细胞内可以直接与细胞相互作用，以排除其它因素的干扰。重组质粒的瞬时表达在短时期内(24h～72h)即可完成，瞬时转染的外源基因进入受体细胞后，不与基因组整合，而只是游离基因组外，结果是短暂的高水平表达，合成大量蛋白。高效率的细胞转染是真核细胞表达外源基因的关键，选择合适的细胞转染方法对提高哺乳动物细胞转染率作用很大。目前较常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、DEAE一葡聚糖转染法、电穿孔法(electroporation)、显微注射法和脂质体(1iposomes)转染法。其中磷酸钙共沉淀转染【74】不需要昂贵的仪器和试剂，经济简便并且对细胞毒性小，所以本实验采用磷酸钙转染法转染HEK293FT细胞。其原理是通过DNA，氯化钙与磷酸缓冲液混合，形成极小不溶的磷酸钙一DNA24 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究沉淀物，并粘附于细胞表面，通过细胞的内吞作用被细胞捕获，进而表达。本研究中采用的真核表达载体pcDNA3．IA是由pcDNA3．1衍生而来的大小约5．5kb的质粒DNA，常用来构建融合表达载体。I)cDNA3．1A具备f75】：(1)在大多数哺乳动物细胞中具有人巨细胞早期立即启动区，可以保证目的基因在哺乳动物细胞高水平稳定的表达；(2)组氨酸(His)融合系统。组氨酸融合表达系统通常是将6个组氨酸(His6)的核苷酸置于待表达基因的N端，亦可置于c端，还可插入到信号肽及待表达的基因之间，表达产物一般融合6个His作为标签，不仅可以通过金属鳌合亲和层析法一步纯化蛋白，也方便了利用Western=blot方法检测融合蛋白的表达。由于没有商品化的抗NSI蛋白的抗体，本研究利用不含终止密码子的下游引物扩增NSl基因，使其与pcDNA3．IA表达载体上的His标签融合，从而利用抗His的抗体来检测NSI基因的表达。结果表明构建的NSl基因表达载体能够有效地介导NSl基因在真核细胞中表达。本研究结果为今后进一步研究NSI蛋白能否诱导宿主细胞凋亡奠定了基础。2．5小结通过PCR方法克隆了CPV-2a型犬细小病毒的NSl基因，将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3．IA上，成功构建了NSl真核表达重组质粒pcDNA-NSl／His和pcDNA-NSl，利用磷酸钙介导法把pcDNA-NSl／His重组质粒转染HEK293FT细胞进行表达，经Westemoblot方法鉴定NS1蛋白能够在真核细胞中成功表达。 河北农业大学硕士学位(毕业)论文3实验二犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导细胞凋亡的研究实验一构建了NSl真核表达载体pcDNA-NSl和pcDNA-NSl／His，并通过在HEK293FT细胞瞬时表达，证明NSl基因能够在体外培养的真核细胞中表达。由于CPV感染不同的细胞系会导致不同的结果，本实验将先研究犬细小病毒CPV．2a型毒株能否诱导F81细胞凋亡，并进一步探讨CPV引起细胞凋亡是否与NSl蛋白有关。3．1材料3．1．1质粒、细胞和病毒pcDNA-NSl／His和pcDNA-NSI为本实验室构建；人胚肾细胞HEK293FT细胞由中科院微生物所惠赠；F81细胞(猫肾细胞)为本实验室保存细胞株；犬细小病毒CPV．2a型毒株由中国农业大学刘维全教授惠赠。3．1．2主要试剂同实验一，另外还有：Caspase．G103／7assay自美国Promega公司；AnnexinVApopotosisDetectionKitFITC购自eBioscience公司；脂质体Lipopectamine俐2000购自invitrogen公司。3．1．3主要仪器：同实验一3．2实验方法3．2．1CPV感染细胞取对数期生长状态良好的F81细胞，以2x105cell／ml接种于24孔或96孔板中，加入CPV(MOh30)病毒悬液作为CPV感染组，同时设置未作任何处理的F81细胞为空白对照。置于37"C，5％C02培养箱培养。由于犬细小病毒CPV可感染F81细胞并在其中增殖，从而在一定的时间内会出现特征性的细胞病变(CPE)，如细胞收缩，脱落裂解，形成空斑等病变现象。观察到特征性CPE后，立即检测细胞凋亡情况。3．2．2CPV感染对宿主细胞凋亡的影响3．2．2．1AnnexinV／PI双染色法检测细胞凋亡将F8I细胞培养在24孔板中，设立空白对照组、CPV感染组；24h后，参照AnnexinV．FITC26 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究ApopotosisDetectionKit试剂盒说明对细胞进行染色。主要过程为：(1)用无菌水稀释10x结合buffer至工作浓度；(2)用PBS洗涤细胞两次，然后用l×结合buffer洗涤细胞一次；(3)用l×结合buffer稀释细胞至5×106cells／mL；(4)取100屿细胞悬浮液于1．5mL离心管中，再加入5旺AnnexinV．F1TC，混匀，室温避光孵育15min；(5)用l×结合buffer洗涤细胞一次，再加入200}lLlx结合buffer和5此PI(250n咖L)重悬细胞，混匀；然后在荧光显微镜下检测细胞凋亡情况。3．2．2．2Caspase．3／7活性检测将F81细胞培养在96孔板中，设立空白对照组、CPV感染组；感染CPV(MOh30)12h，24h，36h和48h后，按照Caspase-G103／7assay试剂盒操作说明，进行以下步骤：(1)把caspase-G103／7缓冲液和caspase—G103／7底物置于室温融化，混匀，形成caspase-G103／7试剂；(2)在培养细胞的96孔板中每孔分别加入100儿caspase-Glo3／7试剂，室温孵育90min，然后用微弱发光测量仪测定相对发光值(RelativeLuminescene)，相对发光值表示caspase．3／7的活性。实验共重复3次。实验数据采用SPSSl8．0统计软件中的t检验方法进行显著性检验。3．2．3NSl基因真核表达质粒转染F81宿主细胞3．2．3．1NSl基因真核表达质粒的提取挑取lO个白色菌落，分别将其接种到盛有10ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。按照WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem试剂盒说明书，进行以下步骤：(1)裂解细胞：取上述培养液1．5mL于1．5mLEp管中，6000r／rain离心，弃上清，重复三次。加入250rtL细胞悬浮液重悬菌体，再加入250皿细胞裂解液，轻柔颠倒4次使其充分裂解，然后加入10此Alkaline蛋白酶，颠倒4次后室温孵育5rain。再加入350pL中和缓冲液，颠倒4次混匀后，12000rpm离心10min。‘(2)质粒DNA的结合：把离心柱放入收集管中，用移液器把(1)中上清液加入离心柱，12000rpm离心1rain，弃去收集管中废液。(3)洗涤DNA：先加入750此洗涤缓冲液于离心柱中，12000rpm离心lmin，弃去收集管中废液，然后加入加入250皿洗涤缓冲液于离心柱中，12000rpm离心1min，最后12000rpm离心2min以弃去洗涤缓冲液。(4)洗脱DNA：把离心柱放入1．5mL离心管中，然后在离心柱中加入100此洗脱缓冲液，12000rpm离心lrain，也可重复洗脱一次提高回收率，DNA置于．20℃保存。3．2．3．2脂质体介导NSl基因真核表达质粒转染F81宿主细胞F81细胞传代24h后，由LipofectamineTM2000脂质体介导用pcDNA-NSl质粒转染贴壁细27 河北农业大学硕士学位(毕业)论文胞(转染组)，同时用pcDNA3．1A空载体转染细胞(阴性对照组)。操作步骤如下：(1)准备细胞：取24孔板，向孔中加入适量细胞悬浮液，置于3TC，5％C02培养箱中培养，待细胞满度为70％左右时，开始转染；(2)转染液制备：A液：把1gg质粒加入1．5mL离心管中，用DMEM稀释至100gL：B液：把2gL脂质体加入1．5mL离心管中，用DMEM稀释至100gL；轻轻混匀A，B液，室温放置5min，然后把AB液混匀，室温孵育20min；(3)转染准备：用500gL无血清培养基洗涤细胞2次，然后加入200pL无血清DMEM培养基于24孔板中。(4)转染：把AB混合液缓缓加入24孔板中，摇匀，置于37℃，5％C02培养箱中培养12~48h后，检测细胞凋亡情况。3．2．4转染NSl基因真核表达质粒对宿主细胞凋亡的影响按照3．2．2操作步骤，通过AnnexinV／PI双染色法检测膜磷脂酰丝氨酸外翻情况，然后测定不同时间caspase．3／7的活性，进一步检测NSl蛋白对F81宿主细胞凋亡情况的影响。3．3结果3．3．1感染CPV对宿主细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻的影响凋亡早期细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻到细胞膜的表面，能够和AnnexinV．FITC特异性结合，在蓝光激发下能够发射绿色荧光。碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)仅能透过破损的细胞膜而和DNA结合，在蓝光照射下呈红色。经过AnnexinV／PI双染，若细胞呈Annexinv(．)／PI(．)，细胞未发生凋亡；若细胞AnnexinV(+)／PI(．)，说明细胞处于凋亡早期；若细胞AnnexinV(+)伊I(+)，则表明细胞处于凋亡晚期或坏死。AnnexinV／PI双染检测结果显示，CPV感染的F8l细胞大部分细胞膜周围呈绿色，个别细胞的细胞核呈红色；而空白对照组的F8l细胞极少数细胞膜周围呈绿色(如图3．1)。实验表明，感染CPV能引起F81宿主细胞的凋亡。28图3-I感染病毒凋亡细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻(AnnexinV-F1TC)的检测分析Fig．3-1AnalysisofmembranephosphatidylserineexternalizationofapoptotiecellsbyAnnexinV-FITCFSIceltswel'estainedwithannexin—VandPIandguNectedtofluorescencemicroscopeanalysis．A：Blankcontrol(F81cellswithouttreatment)；B：F81cellswereinfectedwithCPV． 犬细小病毒NSl非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的研究3．3．2感染CPV对宿主细胞caspase一3／7活性的影响caSpaSe．3／7是细胞凋亡途径中的关键酶，在正常细胞中以酶原的形式存在于胞浆中，在细胞凋亡的早期阶段被激活，活化caspase．3／7裂解细胞内相应的底物，从而导致细胞的凋亡。通过测定caspase一3／7活性可以反映细胞凋亡的情况。Caspase．3／7试剂盒将caspase的酶促反应与荧光素酶发光反应相偶联，通过发光测定仪测定相对发光值(RelativeLuminescene)就可评价caspase．3／7的活性。图3—2为感染CPV后，F81细胞caspase一3／7活性的检测结果。检测结果显示，在感染CPV12h后，F81细胞的caspase．3／7活性开始急剧上升，在24h时caspase-3／7活性达到最大值，明显高于空白对照组(P<0．01)。但随着时间的进一步延长，caspase一3／7的活性表现快速下降，36h时caspase．3／7的活性仅为24h时的l／3。由此可见CPV诱导F8l细胞凋亡的作用在感染后24h时最明显。此后随着细胞趋于凋亡晚期并出现坏死，凋亡作用逐渐减弱，caspase．3／7活性呈现明显下降趋势。奉幸亡|12口B1ankcontr01■CPVinfectiOn木木亡I48t}h图3-2感染病毒对F81细胞caspase-3／7活性的影响Fig．3-2111eeffectofCPVinfectiononcaspase-3／7activity．Blankcontrol，F81cellswi山outtreatment；CPVinfection，F8lcellsWC：|IfeinfectedwithCPV+P<0．05·+’|D<0．01comparedwithBlankcontr01．3．3．3转染NSl基因真核表达载体对F81细胞磷脂酰丝氨酸外翻的影响在24孔板中培养的F81细胞，通过脂质体介导NSI基因表达质粒转染24h后，采用AnnexinV／PI双染法检测宿主细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻情况(见图3—3)，结果显示，转染pcDNA-NSl质粒的F81细胞部分细胞膜周围呈绿色，个别细胞的细胞核呈红色：而空载体阴性对照组的F81细胞极少数细胞膜周围呈绿色。实验表明，转染NSl基因表达载体能引起F81宿主细胞的凋亡，由此可见CPV引起细胞凋亡与其编码的NSl蛋白有密切关系。29：}}工■■o_一3O0拍∞弘∞药加坫m0 河北农业大学硕士学位(毕业)论文图3．3转染NSI基因表达质粒细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻(Annexin．V-FITC)的检测分析Fig．3-3AnalysisofmembranephosphatidylserineexternalizationofapoptoticcellsbyAnnexinV-FITC．FSIcellswerestainedwithannexin·VandPlandsubjectedtofluorescencemicroscopeanalysis。A：Negativecontrol(F81cellstransfectedwithpcDNA3．1A)：B：F81cellswentransfectedwithpcDNA—NSI．3．3．4转染NSl基因表达载体对F81细胞caspase．3／7活性的影响在96孔板中培养的F8l细胞，通过脂质体介导NSl基因表达质粒转染12，24，36，48h后，分别检测caspase一3／7的活性(见图34)。检测结果显示，在转染NSl质粒的F8l细胞中，转染后24h其caspase．3／7活性变化与感染CPV细胞的活性变化基本相似，caspase一3／7的活性达到最大值，并与同时期感染CPV细胞的caspase．3／7活性相近。然而随着时间的延长，Caspase一3／7活性下降的速度与感染CPV细胞caspase．3／7活性下降的速度相比明显变慢。上述结果表明，感染CPV和转染NSl基因均能引起F8l细胞的凋亡，这进一步证明在CPV诱导宿主细胞凋亡过程中NSl蛋白起到重要作用。30lZZ43648￡／h图3-4转染NSI基因对F81细胞caspase．3／7活性的影响Fig．3-4111eeffectofNSigenetransfectiononcaspase-3／7activity．pcDNA·NSItransfection，FSIcellsWCl'etransfectedwithpcDNA-NSI；Negativecontrol，F81cellsweretransfectedwithpcDNA3．IA．+P1953年以来所有文章全文上网(285)·<微生物学报>关于署名(303)·<微生物学报)综述文章投稿最新要求(310)·<微生物学报》审稿程序(352)·《徼生物学报>投稿方式(380)·系统发育树的构建方法(388)·<微生曲学报》征稿简则(文后)·《微生物学报>编委会名单(文后)·<微生物学报>致谢审稿专家·(微生物学报>欢迎刊登广告(封三)拿纠岬S广告S毛t!雪!个$·安琪酵母股份有限公司(文前I／Ⅱ)·生物谷(文前Ⅱl／lV)·镇江东方生物工程设备技术有限责任公司(文前V／V1)封面图片：炭疽芽胞杆菌BslA(260—652)蛋白的表达纯化与黏附功能鉴定(见360一366页，安徽大学生命科学学院，军事医学科学院生物工程研究所，病原微生物与生物安全国家重点实验室，马坤、王艳春、陶好霞、董杰、曹诚、张部昌、刘纯杰等人的文章)f 微生物学报Acta．1,1icrobiologicaSinica52(3)：367—373：4March20121SSN0001—6209：CN11—1995／Qhttp：／／journals．im．ac．cn／actamicrocn犬细小病毒NSl非结构蛋白可诱导细胞凋亡潘红丽1，仲飞p，潘素敏1’3，李秀锦2，张峰1，张考1，陈慧慧1’河北农业大学动物医学院基础兽医部，农业部动物疫病病原生物学华北科学观察实验站，保定0710012燕山大学环境与化学工程学院生物工程系，秦皇岛0660043河北科技师范学院动物科技学院，秦皇岛066004摘要：【目的】研究犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)非结构蛋白NSI在CPV引起宿主细胞凋亡中的作用，初步探讨CPV引起细胞凋亡的机制。【方法】首先采用PCR方法从犬细小病毒基因组中扩增NSI编码基因，然后利用pcDNA3．1A质粒构建NSI真核表达载体pcDNA-NSI，并通过HEK293FT细胞瞬时表达NSI重组蛋白，用Western-blot检测以确定重组NSI蛋白能否在真核细胞中表达。然后用CPV感染和用peDNA—NSI表达载体转染F8l宿主细胞，通过AnnexinV／PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻和通过化学发光法检测caspase-3／7活性，分析感染CPV或转染NSI基因对F8l宿主细胞凋亡的影响。【结果】结果表明，本实验扩增的NSI基因序列与GenBank的序列一致，构建的表达载体结构正确，并能够介导NSl基因在真核细胞中表达。感染CPV和转染NSl基因均能诱导F8l细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和明显提高细胞内easpase-3／7的活性，表明CPV和NSI蛋白均能引起细胞的凋亡。【结论】CPV诱导宿主细胞凋亡与其编码的NSI非结构蛋白有关。关键词：犬细小病毒，NSI蛋白，细胞凋亡中图分类号：$852文献标识码：A文章编号：0001-6209(2012)03-0367-07犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)引起的一种急性传染病。此病主要表现急性出血性胃肠炎和急性心肌炎，传染性强，发病率和死亡率高，是一种危害犬，特别是幼犬的一种重要的传染性疾病u～。近20多年来，国内外学者对犬细小病毒病的流行病学、病原生物学、诊断和防治方面进行了大量研究口。1，但对犬细小病毒病的发病机制了解甚少。已有研究证实吲，在体内CPV感染可诱导肠粘膜上皮细胞的凋亡和坏死，进而引起继发感染。芬兰学者JannaNykky等¨1研究发现在体外CPV感染猫肾细胞NLFK和犬纤维瘤细胞A72可以引起细胞凋亡。CPV是如何引起细胞凋亡的，这一作用与病毒的哪一种编码蛋白有关尚未见报道。许多学者在研究其它动物(包括人)的细小病毒时发现，细小病毒感染细胞后可以引起细胞的凋亡和坏死，并且证明这一凋亡作用与病毒的NSl非结构蛋th有关。如Hristov等婚’研究表明鼠细小病毒H_1的NSI蛋白能够使细胞周期停滞在G2期，从而诱导细胞凋亡：Moffatt等例研究显示人细小病毒B19的NSI蛋白通过激活caspase-3诱导红基金项目：国家自然科学基金(30771586)：河北省自然科学基金(C2008000244)‘通信作者。Tel：+86412-7528473：E-mail：feizhon92000@yahoo．corn作者简介：潘红丽(1986一)，女·河北石家庄人．硕士研究生，主要从事基因工程与分子免疫学方面的研究。E-mail：panhonglil2345@126Com收稿日期：2011—10一17：修回日期：2012-01—13 368HongliPaneta1．／ActaMicrobiologicaSinica(2012)52(3)细胞系K562和U17／EPO细胞的凋亡。由此可见NSI蛋白是细小病毒非常重要的致病因子。为了研究CPV引起细胞凋亡是否与病毒NSI非结构蛋白有关，本实验在细胞水平上通过转染NSI基因，研究NSl蛋白对细胞凋亡的影响。1材料和方法1．1材料1．1．1菌种、载体、细胞株及病毒：大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5ct由本实验室保存：pcDNA3．1A载体购自美国Invitrogen公司：人胚胎。肾细胞HEK293FT由中科院微生物所惠赠：猫肾细胞F8l为本实验室保存细胞株：犬细小病毒CPV乏a型毒株“训由中国农业大学刘维全博士惠赠。1．1．2主要试剂和仪器：限制性内切酶，IPTG，X—gal，质粒小量提取试剂盒，Caspase-G103／7assay均购自美国Promega公司：蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxoid公司：琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司：预染蛋白分子量Marker购自Bio-RadLaboratories公司：小鼠抗His单克隆抗体购自SantaCruzBioteehnology公司：碱性磷酸酶标记兔抗小鼠IgG抗体购自VectorLaboratories公司：TansStartFastPfuDNA聚合酶，pEASY-BluntCloningKit均购自北京全式金生物技术有限公司：AnnexinV--FITCApopotosisDetectionKit购自eBioscience公司：DMEM，胎牛血清均购自Gibco公司：脂质体Lipopectamine“2000购自invitrogen公司：其它试剂均为国产分析纯。ATC201型PCR仪为美国阿波罗公司产品：MCO-15AC型CO，恒温培养箱为日本三洋公司产品：CX3l荧光显微镜为日本Olympus公司产品：BPCL-L微弱发光测量仪为中国科学院生物物理研究所产品。1．2NSl基因的克隆参考GenBank已发表的犬细小病毒非结构蛋白NSl基因的序列(No．M一19296)，设计2对引物用于扩增犬细小病毒NSl基因(表1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1扩增犬细小病毒NSI基因的引物TablelPrimersforamplificationofCPVNSIgeneThesizesoftheamplifiedPCRproductsincludethecorrespondingprimers．TheitalicandunLlerlinedlettersindicaterestrictionsites．TheshadowedlettersrepresentthecomplementarysequencesagainstthetemplateDNA鉴于实验室目前缺少犬细小病毒NSl蛋白的特异性抗体，在下游引物NSl／MH-R设计时去除犬细小病毒NSl基因的终止密码子，这样可将犬细小病毒NSl基因与pcDNA3．1A载体上的His标签融合，便于表达产物的鉴定。另一个下游引物NSl-R中包含终止密码子，用于构建与His标签非融合真核表达载体。用犬细小病毒感染F81细胞，采用Hirt法uu提取病毒基因组DNA，然后以病毒基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增犬细小病毒NSI基因。PCR热循环条件：940C预变性4min，94。C变性1min，58℃退火lrain，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min，用l％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后将纯化的PCR产物克隆到pEasy-Blunt载体h送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1．3NSl基因表达载体的构建利用peDNA3．1A真核表达载体，通过BamHl和AgeI位点分别将NSl基因从pEasy--Blunt载体上转到pcDNA3．1A质粒中的BamHI和AgeI位点上，构建成与His标签融合和与His标签非融合的NSl基因的真核表达载体，pcDNA-NSl／His和pcDNA-NSI。1．4NSl蛋白的表达及鉴定用质粒抽提试剂盒制备pcDNA--NSI／His重组质粒，采用磷酸钙转染法”21将15斗g重组质粒转染"1"25细胞瓶培养的HEK293FT细胞，48h后裂解细胞。与此同时，用空载体peDNA3．1A转染HEK293FT细胞作为阴性对照。 潘红丽等：犬细小病毒NSI非结构蛋白可诱导细胞凋亡．／微生物学报(2012)52(3)369采用Westernblot法鉴定表达产物，首先蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳，然后印迹到硝酸纤维膜上，在含有5％脱脂奶粉的TBST中4℃封闭过夜。然后用l：500倍稀释的鼠抗划is单克隆抗体(一抗)在室温杂交2h，再以l：500倍稀释碱性磷酸酶标记羊抗小鼠抗体(二抗)杂交lh，最后加入2ml显色液(NBT／BCIP)显色5一10min，自来水冲洗终止反应，根据膜上的显色带判断结果，最后用扫描仪记录显色图谱。1．5细胞感染和转染细胞感染：取对数期生长状态良好的F8l细胞，以2X105细胞／ml接种于24孔或96孔板中，加入CPV(MOI：30)病毒悬液作为CPV感染组，同时设置未作任何处理的F81细胞为空白对照。细胞转染：F8l细胞传代24h后，由Lipofectamine2000脂质体介导用pcDNA-NSI质粒转染贴壁细胞(转染组)，同时用pcDNA3．1A空载体转染细胞(阴性对照组)。1．6AnnexinV／PI双染色法检测细胞凋亡将F8l细胞培养在24孔板中，设立空白对照组、CPV感染组、转染pcDNA-NSl组和阴性对照组：24h后，参照Annexin-V-FITCApopotosisDetectionKit试剂盒说明对细胞进行染色。主要过程为：用胰酶消化细胞，用PBS洗细胞3次，将细胞悬浮于结合缓冲液中。取100斗L细胞悬浮液，加入5斗LAnnexin-V-FITC和5斗L250ng／斗LPI，混匀后室温避光孵育15min，用结合缓冲液洗一次，然后在荧光显微镜下检测细胞凋亡情况。{A)CMVNSIgene⋯”—弦磁纠■■■—l卜⋯⋯Ix：DNA·NSBorn[II，·Ige18amttIAgeI1．7Caspase-3／7活性检测将F8l细胞培养在96孔板中，设立空白对照组、CPV感染组、转染pcDNA-NSl组和阴性对照组：感染CPV(MOI：30)和转染质粒12h，24h，36h和48h后，按照Caspase-G103／7assay试剂盒操作说明，加入100¨LCaspase--G103／7试剂于96孔板中，轻轻的混匀，室温孵育90min，然后用微弱发光测量仪测定相对发光值(RelativeLuminescene)，相对发光值表示Caspase-3／7的活性。实验共重复3次。1．8数据统计方法采用SPSSl8．0统计软件中的t检验方法对数据进行显著性检验。2结果2．1NSI基因的扩增和真核表达载体的构建以CPV的DNA为模板，利用设计的2对引物，依据设定的条件通过PCR方法扩增出了PCR产物，扩增的PCR片段约为2030bp，与预期的片段大小～致。经过测序证明，本试验扩增的NSI基因序列与GenBank发表的序列一致。利用BamHI和Agel将此DNA片段插入peDNA3．1A载体上构建NSI真核表达载体peDNA--NSI／His和pcDNANSI(图1-A)。重组质粒分别用BamHI和AgeI双酶切鉴定均得到约5．5kb(载体)和2000bp的2条DNA片段，2000bp的小片段即为犬细小病毒NSI基因，表明已将其克隆到pcDNA3．1A载体上(图1一B)。‘‘‘‘⋯pcDNA-NSI／His--!图lNSl表达载饰=的结构及酶切鉴定图谱Fig．1StructureandrestrictionanalysisofNSIexpressionvectors．(A)：NSIgeneexpressionvectors．CMV，humancytomegalovirus(CMV)promoler：NSl，non-s,tructura]protein--Iofcanineparvovirus：His，6xhistidinetag．(B)：RestrictionanalysisofNSIgeneexpressionvectors．Lane1，pcDNA-NSI／HisdigestedbyBamHIandAge1：Lane2peDNA-NSidigestedbyBamH1andAgel：M．DL2000DNAMarker．2．2NSI在HEK293FT细胞中的表达为证明构建的pcDNA--NSI真核表达载体能否在真核细胞中进行表达，本研究通过磷酸钙介导将NSl基因表达载体pcDNA-NSI／His转染HEK293FT细胞，48h后裂解细胞，通过Westernblot检测细胞中表达的NSI融合蛋白，结果见图2。由图2可见， 370HongliPaneta1．／ActaMicrobiologicaSinica(2012)52(3)在分子质量约70kDa处有1条明显的杂交带，而空载体在相应位置未见杂交带，这说明NSl基因能够在真核细胞中表达。kDa209．()一j24．0—800一49．1—348——图2Westernblot检测重组NSI在HEK293FT细胞的表达Fig．2DetectionofrecombinantNSlexpressedinHEK293盯cellsbyWestern--blot．Lane1，thesamplefrompcDNA3．1A-transfectedcells：Lane2，thesamplefrompeDNA-NS!／His-transfectedcells：M，prestainedproteinmarker．2．3感染CPV和转染NSl表达载体对F81细胞凋亡的影响凋亡早期细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻到细胞膜的表面，能够和AnnexinV-FITC特异性结合，在蓝光激发下能够发射绿色荧光。碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)仅能透过破损的细胞膜而和DNA结合，在蓝光照射下呈红色。经过AnnexinV／PI双染，若细胞呈AnnexinV(一)／PI(一)，细胞未发生凋亡：若细胞AnnexinV(+)／PI(一)，说明细胞处于凋亡早期：若细胞AnnexinV(+)／PI(+)，则表明细胞处于凋亡晚期或坏死。AnnexinV／PI双染检测结果显示，CPV感染的F81细胞和转染pcDNA-NSl质粒的F8l细胞部分细胞膜周围呈绿色，个别细胞的细胞核呈红色：而空白对照组和空载体阴性对照组的F8l细胞极少数细胞膜周围呈绿色(如图3)。实验表明，感染CPV和转染NSl基因表达载体均能引起F81宿主细胞的凋亡，由此可见CPV引起细胞凋亡与其编码的NSI蛋白有密切关系。图3凋亡细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻(Annexin-V-FITC)的检测分析Fig．3Analysisofmembraneph08phatidylserineexternalizationofapoptoticcellsbyAnnexinV-FITC．F81cellswerestainedwithAnnexin-VandPIandsubjectedtofluorescencemicroscopeanalysis．A：Blankcontrol(F81ceilswithouttreatment)：B：Negativecontrol(F81cellstransfectedwithpcDNA3．1A)：C：1；'81cellswereinfectedwithCPV：D：F81cellsweretransfeetedwithpcDNA-NSI．2．4Caspase-3／7活性的测定Caspase-3／7是细胞凋亡途径中的关键酶，在正常细胞中以酶原的形式存在于胞浆中，在细胞凋亡的早期阶段被激活，活化caspase-3／7裂解细胞内相应的底物，从而导致细胞的凋亡。通过测定caspase-3／7活性可以反映细胞凋亡的情况。Caspase-3／7试剂盒将caspase的酶促反应与荧光素酶发光反应相偶联，通过发光测定仪测定相对发光值(RelativeLumineseene)就可评价caspase-3／7的活性。图4为感染CPV和转染pcDNA--4NSI质粒后，F81细胞caspase-3／7活性的检测结果。检测结果显示，在感染CPV12h后，F8l细胞的caspase-3／7活性开始急剧上升，在24h时caspase一3／7活性达到最大值，明显高于空白对照组(P<0．01)。但随着时间的进一步延长，caspase-3／7的活性表现快速下降，36h时caspase-3／7的活性仅为 潘红丽等：犬细小病毒NSI非结构蛋白可诱导细胞凋亡．，微生物学报(2012)52(3)37l__—————————————————————————————————————————————————————————————一三‘广寓．广i．广亩．j12243648t／h12243648t／h图4感染CPV和转染NSl基因对F81细胞caspase-3／7活性的影响Fig．4TheeffectofCPVinfectionandNS!genetransfectionOIIcaspase-3／7activity．(A)：CPV-infectedcells．Blankcontrol，F81cellswithouttreatment：CPVinfectlon，F8IceIIswereinfectedwithCPV．’P<0．05，“P(0．01comparedwithblankcontr01．(B)：NSI-transfectedcells．pcDNA-tNSItransfection，F81cellsweretransfectedwithpcDNA—NSI：Negativecontrol，FSIcellsweretransfectedwithpcDNA3．1A．’P<0．05，印<0．01comparedwithnegativecontr01．24h时的l，3。由此可见CPV诱导F8l细胞凋亡的作用在感染后24h时最明显。此后随着细胞趋于凋亡晚期并出现坏死，凋亡作用逐渐减弱，caspase-3／7活性呈现明显下降趋势。在转染NSl质粒的F8l细胞中，转染后24h其caspase-3／7活性变化与感染CPV细胞的活性变化基本相似，caspase-3／7的活性达到最大值，并与同时期感染CPV细胞的caspase-3／7活性相近。然而随着时间的延长，Caspase-3／7活性下降的速度与感染CPV细胞caspase-3／7活性下降的速度相比明显变慢。上述结果表明，感染CPV和转染NSl基因均能引起F8l细胞的凋亡，这进一步证明在CPV诱导宿主细胞凋亡过程中NSl蛋白起到重要作用。3讨论与其它动物细小病毒一样，CPV是感染犬最简单的病毒之一，CPV编码的结构蛋白和非结构蛋白在病毒的增殖过程中均起重要作用。NSI蛋白是该病毒重要的非结构蛋白，在病毒复制的早期NSI大量表达，研究证实NSl在病毒复制和转录等过程发挥重要作用n3一钉。病毒在宿主细胞中大量增殖必定会严重干扰宿主细胞的正常功能，病毒编码的蛋白，特别是非结构蛋白对宿主细胞功能的干扰作用较大。为研究CPVNSI非结构蛋A对细胞凋亡的影响，本实验构建了NSl基因的真核表达载体，通过转染F8l宿主细胞，研究NSI蛋白对细胞凋亡的影响。由于NSI基因表达载体不含信号肽序列，所以表达的重组NSI蛋白存在于细胞内，与自然感染CPV一样，重组NSl蛋自在宿主细胞内可以直接与细胞相互作用，以排除其它因素的干扰。本实验之所以选用pcDNA3．1A载体表达NSI蛋白是因为该钱体不仅含有较强的人类巨细胞病毒CMV启动子，而且还具有用于构建与His标签融合的重组蛋白，以便于重组蛋白的鉴定。本实验分别构建了DcDNA--NSl／His和pcDNA-4NSl两个真核表达载体，前者用于鉴定构建的NSl表达载体能否介导NSI在细胞内表达，后者则用来研究NSI蛋白诱导细胞的凋亡作用。采用磷酸钙转染方法在HEK293FT细胞中瞬时表达重组蛋白，是目前人们在确定构建的表达载体能否介导目的基因在真核细胞中表达和小规模制备重组蛋白较为理想的方法。由于此方法比较经济，操作简单，所以受到人们的青睐。为此本实验也采用了HEK293FT细胞表达系统，证明构建的NSI基因表达载体能够有效地介导NSI基因在真核细胞中表达。重组NSl在细胞内的有效表达是研究NSI蛋白诱导细胞凋亡作用的重要条件。细胞的凋亡涉及多种基因的激活和表达，不同的基因产物对细胞的凋亡有不同的作用，有的起促进作用，而有的起抑制作用。Caspase是细胞凋亡过程中一类关键的同源半胱天冬氨酸蛋白酶。在细胞的凋亡过程中，参与细胞凋l二=起始阶段的启动caspases(如caspase-2，8，9，10)在外来信号的作用下被切割激活，激活的启动caspases对执行caspases(如caspase-3，6，7)进行切割使其激活，被激活的执行caspase通过对多种靶蛋白的水解，导致细胞凋亡¨“。Caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡执行者，通过降解DNA修复酶PARP(poly淼淼淼淼姗o4322●●8col暑In—p^I暑一若～删№¨工墨■量一私[毓。』荆渊¨二■■■1吨XE一口-．J¨工■霸曩墨■I—上．量一．．一．．．．一忙淼勰淼淼|l。笤Il口键兰善，Ia^Il卫星m 372HongliPaneta1．／AcreMicrobiologicaSinica(2012)52(3)ADP-ribosepolymerase)“叫，活化DNA裂解因子DFF-45(DNAfragmentationfactor-45)u”，导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解，从而诱导细胞的凋亡。Annexin-V／PI双染法和easpase-3／7活性检测实验结果显示，感染CPV和转染NSI基因均能诱导F81细胞膜磷腊酰丝氨酸外翻，caspase-3／7活性都明显高于对照细胞，表明感染CPV和转染NSI基因都能诱导F81细胞发生凋亡，其作用机制可能是通过上调caspase蛋白酶活性，从而诱导细胞凋亡。由此可见，在CPV诱导宿主细胞凋亡过程中，NSI蛋白起了重要作用。本研究证实CPV编码的非结构蛋白NSI在CPV诱导细胞凋亡过程中起重要作用，是引起细胞凋亡的重要因子。但有关NSI如何引起细胞凋亡的详细机制还有待进一步探讨。参考文献[1]ParrishCR．Emergence，naturalhistoryandvariationofcanine，minkandfelineparvovirus．AdvancesinVirusResearch，1990，38：403-450．[2]Llamas-SaizAL，Agbandje-McKennaM，Parkerjs，WahidAT，ParrishCB，RossmannMG．Structuralanalysisofamutationincanineparvoviruswhichcontroisantigenieityandhostrange．Virology，1996，225(1)：65刁1．[3]JenniferP．Canineparvoviralenteritis：areviewofdiagnosis，management，andprevention．JournalofVeterinaryEmergencyandCriticalCare，2004，14(3)：167-476．[4]韩冬梅，仲飞，李秀锦，王徽，王幸兴，潘索敏。大肠杆菌LTB亚基基因表达载体对犬细小病毒VP2DNA疫苗免疫应答的增强作用．微生物学报(ActaMicrobiolagicaSinica)。2011，51(1)：91-97．[5]王微，李秀锦，仲飞。王幸兴，韩冬梅，靳慧君，潘素敏，李巍．犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性．微生物学报(ActaMicrobiologicaSinica)，2009，49(5>：648-652．[6]BauderB，SuchyA，GablerC，WeissenbfickH．Apoptosisinfelinepanleukopeniaandcanineparvovirusenteritis．Journalofveterinarymedicine．B，Infectiousdiseasesandveterinarypublichealth，2000，47(10)：775-784．[7]Nykkyj，TuusaJE，KirjavainenS，VuentoM，GilbertL．Mechanismsofcelldeathincanineparvovirus-infectedcellsprovideintuitiveinsightstodevelopingnanotoolsformedicine．InternationalJournalofNanomedicine，2010，5：41"1-428．[8]HristovG，gramerM，LiJ，El--AndaloussiN，MoraR，Dae虹1crL，ZentgrafH。RommelaereJ，MarchiniA．ThroughitsnonstructuredproteinNSI，parvovirusH—inducesapoptosisviaaccumulationofreactiveoxygenspecies．JournalofVirology，2010，84(12)：5909-5922．[9]MoffattS，YaegashiN，TadaK，TanakaN，SugamuraK．HumanparvovirusB19nonstructural(NSI》proteininducesapoptosisinerythroidlineagecells．Journal可Virology，1998，72(4)：3018-3028．Do]刘维全，范泉水，江禹，夏咸柱，黄耕，王吉贵，房金波，王蕾．肉食兽细小病毒通用PCR诊断技术的建立．中国兽医学报(ChineseJournal矿VeterinaryScience)，200l，21(3)：249-251．[11]HirtB．SelectiveextractionofpolyonaDNAfrominfectedmousecellcultures．MolecularBiology，1967，26(2)：365369．D23FrederickMA，RobertEK，SeidmanJG。KevinS，RogerB，DavidDM，JohnAS．精编分子生物学实验指南．颜子颖，王海林译．第三版．北京：科学出版社．1998：3lO弓lI．D3]ChristensenJ，TattemallP．ParvovirusinitiatorproteinNSIandRPAcoordinatereplicationfbrkprogressioninareconstitutedDNAreplicationsystem．Journa／ofVirology，2002，76(13)：6518-6531．D4]RhodeSL．trans-AotivationofparvovirusP38promoterbythe76Knoncapsidprotein．JournalofVirology，1985，55(3)：886-889．B5]岳原亦，张扬，张一奇．Caspase家族与细胞凋亡．中国医疗前沿(NationalMedicalFrontiersofChina)，2011，6(6)：25-26．D6]LazebnikYA，KaufmannSH，EarnshawWC．CleavageDesnoyersS·PoirierGG·ofpoly(ADP-ribose)polymerasebyaproteinasewithpropertieslikeICE．NatⅡre，1994，371(6495)：346-347．E17]刘斌剑．DFF和CIDE介导细胞凋亡的分子机制．国外医学．分子生物学分册．2003，25(1)：4447． 潘红丽等：犬细小病毒NSI非结构蛋白可诱导细胞凋亡．，微生物学报(2012)52(3)373Non-structuralproteinNS1oftheapoptosisofcellscanineparvovlrus●llnnUCeSHongliPanl，FeiZhongp，SuminPanl”，XiujinLi2，FengZhan91，KaoZhan91，HuihuiChert1。DepartmentofBasicVeterinaryMedicine，CollegeofVeterinaryMedicine，A咖culturalUniversityofHebei，NorthChinaResearchCenterofAnimalEpidemicPathogenBiology，MinistryofAgricultureofChina，Baoding071001，China2DepartmentofBiotechnology，CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering，YanshanUniversity，Qinhuangdao066004，China’DepartmentofAnimalScience，HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology，Qinhuangdao066004，ChinaAbstract：[objective]Toinvestigatetheeffectsofcanineparvovirus(CPV)non--structuralprotein4(NSI)onthecellapoptosisinducedbyCPVandpreliminarilyexplorethemechanismofCPVqnducedapoptosis．DMethods]First，theNSIgenewasamplifiedbyPCRfromCPVgenomicDNAandsubclonedintopcDNA3．1AvectortogenerateNSIeukaryoticexpressionvectorpeDNA-NSl．ToverifywhetherpcDNA--NSIvectorcanmediateNSIexpressionineukaryotiecells，thehumanembryokideny(HEK)293FTcellswereusedtotransientlyexpresstherecombinantNSI．TheefiectsofNSIonCPV-inducedapoptosiswereinvestigatedbyinfectingtheF81hostcellswithCPVandtransfectingthecellswithNSIvector．TheapoptosisofthecellswasdetectedbyAnnexinV／PIdoublestainingforphosphatidylserineexternalizationonmembraneandbyluminescencemethodforcaspase-3／7activities．[Results]TheresultsshowthatthesequenceofNSIgeneamplifiedwasconsistentwiththeGenBank．TheNSIexpressionvectorwasshowntobecorrectandcouldmediateNSIexpressionineukaryoticcells．Thephosphatidylserineonoutsideofmembranewasdetectedandthecaspase-3／7activitieswereincreasedinbothCPVqnfoctedcellsandNSI-transfectedcells．TheseresultsindicatethatbothCPVandNSIproteincaninducetheapoptosisofthecells．[Conclusion]CPV-inducedapoptosiswascloselyrelatedtoitsnon—structuralproteinNSl．Keywords：canineparvovirus，NSIprotein，cellapoptosis(本文责编：王晋芳)SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(30771586)andbytheNationalNaturalScienceFoundationofHebe(C2008000244)‘Correspondingauthor．Tel：+86--312--7528473：E-mail：feizhon92000@yahoo．cornReceived：17October201I／Revised：13January2012