日本乙型脑炎病毒诱导宿主细胞自噬的研究

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1、分类巧：１１单位代码：００９密级：学号；Ｂ０９２０４１１２ｆ询少ｔ乂夺博±学位论文日本乙型脑炎病毒诱导宿主细胞自隘的研究ＡｕｔｏｐｈａｇｙＩｎｄｕｃｅｄｂｙＪａｐａｎｅｓｅＥｎｃｅｐａｌｉｔｉｓＶｉｒｕｓｉｎＨｏｓｔＣｅｌｌｓ研究生：王秀锦指导教师；郭蠢教授合作指导教少币：杨汉春教授申请学应ｎ类级另＂：农学博±专业名称：预防兽民学研究方向：动物分子病毒学与免疫学所在学院：动物医学院２０１５年１１月

2、Ｐｈ．ＤＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＰｈ．ＤＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＸｉｕｉｎＷａｎｊｇＳｕｅｒｖｉｓｏｒ：ＰｒｏｆｅｓｓｏｒＸｉｎＧｕｏｐＰｒｏ托巧ｏｒＨａｎｃｈｕｎＹａｎｇＭａｏｒ；ＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔ；ｅｒｉｎａｒＭｅ出ｃｉｎｅｊｙＲｅｓｅａｒｃｈＦｉｅｌｄ；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＣｈｉｎａ乂ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙ２０１５本研究受农业公益性行业专项。猪乙型脑炎的防控技术

3、体系研究＂与示范资助项目编号：２００８０３１５独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的一学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。，学位论文作者签名：时间：２。松年｜月曰（４关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中

4、国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部口和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博±学位论文全文数据库》或《中国优秀硕±学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）２ｆ学位论文作者签名：；｜ｒ时间年１月日｜导师签名：时间：广年分月；！日＾摘要日本乙型脑炎病毒一（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖ

5、ｉｒｕｓＪＥＶ）是种重要的人畜共患病原，其宿主范，围广泛，可Ｗ感染晒齿动物，还可ＪＥＶ，感、家畜及人Ｗ感染多种传代细胞系。猪是的储存宿主染后可导致妊娠毋猪流产，产死胎、崎胎、木乃仿胎等，给养猪业造成经济损失。此外，ＪＥＶ还可Ｗ通过蚊虫町咬传播给人，造成感染者雜痕甚至死亡。因此，深入研究压Ｖ的致病机制具有重２００８－２０耍的公共卫生学意义。本实验室年１１年在国内部分规模化猪场开展的血清学调查结果显ＪＥＶ示，我国猪群中抗体阳性率普遍较高，且现阶段ＪＥＶ流行优势毒株与传统疫苗毒株间已存

6、在巧大差异，。目前有关圧Ｖ的致病机制尚未完全阐明，本研究Ｗ细胞白随现象为切入点围绕病毒复制与细胞自幢的相关性展开硏究，旨在从先天性免疫角度为ＪＥＶ分子致病机制的研究提供新线索。运用透射电镜ｅｏＶ－４－２、ＷｓｔｅｒｎＢｌｔ和激光共聚焦免疫巧光等技术，对ＪＥ疫苗株ＳＡ１４１跋染－２－后ＢＨＫ１、ＰＫ１５和Ｎ２Ａ细胞的自隨活性分别进行了定性检测和定量分析。结果显示，化Ｖ感染可导致３种宿主细胞胞浆内产生大量双层膜和单层膜的自隨体样囊泡，同时胞内白隨体标忠分－－－子ＬＣ３ＩＩ含量、ＬＣ３

7、Ｉ向ＬＣ３ＩＩ的转化量Ｗ及宿主细施的自隨流量均显著提高Ｊ；ＥＶ感染后，宿主细胞内ＬＣ３信号大量増加，呈点状聚集，且该信号能与ＪＥＶ非结构蛋白ＮＳ１发生共定位。Ｗ上结果表明，ＪＥＶ感染能够诱导多种宿主细胞发生自隨。Ｒａａｍｃ３－ｓＲＮＡ利用自隆诱导剂ｐｙｉｎ、自隨抑制剂ＭＡ及特异性ｉｓ改变宿主细胞的自随活性，而后接种ＪＥＶ，检测病毒在细胞中复制能力的变化ａａｍｃｎ。结果显示，Ｒｐｙｉ诱导细胞自隨巧，感－染细胞内外的病毒滴度显著增加，而用３ＭＡ或ｓｉＲＮＡ抑制细胞自隨活性后，感染细胞内外的

8、病毒滴度显著降低。结果表明，宿主细胞自随活性的改变影响了病毒在细胞中的增殖过程，且自隨活性的增加有利于ＪＥＶ在细胞中的增殖。ＷＰＣＭＶ为载体，构建ＪＥＶ结构蛋白和非结构蛋白共９个真核表达重组质粒，分别转染－－ＢＨＫ２１细，２１胞分析病毒蛋白与ＢＨＫ细胞自隨发生的相关性，ＪＥＶ结。结果显示构蛋白Ｃ、－Ｍ及非结构蛋白ＮＳ３的表达能够提高细胞内自睡标志分子ＬＣ３ＩＩ的含量及自隨体样義泡的数量，且蛋白标签与细