禽呼肠孤病毒sigma-c蛋白引起宿主细胞凋亡的分子机理研究

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1、分类号：单位代码：密级号博士学位论文貪呼肠孤病毒蛋白引起宿主细胞调亡的分子机理研究研究生：张志强指导教师：郑世军教授申请学位门类级别：农学博士专业名称：预防兽医学研究方向：动物分子病毒学与免疫学所在学院：动物医学院Ph.D.DissertationPh.D.Candidate:ZhiqiangZhangSupervisor:Prof.ShijunZhengMajor:PreventiveVeterinaryMedicineResearchField:AnimalMolecularVirology&ImmunologyChinaAgriculturalUni

2、versityMay,2015本研究由国家自然科学基金项目（项目编号：和以及国家蛋鸡产业技术体系（项目编号资助独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：年月曰关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文旳规定。本人同意中

3、国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）学位论文作者签名：时间：广年月曰摘要禽呼肠孤病毒（感染引起家禽的病毒性关节炎、慢性呼吸道症状、生长迟缓和吸收不良综合征等疾病，给家禽养殖业造成重大经济损失。诱导细胞凋亡是造成病毒感染所引起组织损伤的重要诱因，在病毒蛋白中，蛋白被证实能够诱导细胞凋亡，但其诱导凋亡的分子机理尚不明确。本研

4、究利用流式细胞术检测细胞凋亡，确认过表达蛋白能够在、和三种细胞上诱导细胞凋亡。为进一步探寻蛋白引起细胞凋亡的分子机理，以蛋白作为“诱馆”蛋白，利用酵母双杂交技术从鸡脾脏文库中寻找与蛋发生相互作阳的宿主细胞靶蛋白，并通过半？糖苷酶实验加以确认。为给后续研究提供必要实验工具，以原核表达的重组蛋白免疫小鼠，最终得到两株细胞株可以稳定分泌针对蛋白高特异性、高亲和力单克隆抗体。和间接免疫焚光实验结果表明，所得两株单抗能够特异性识别感染细胞中病毒蛋白，为深入研究的生物学功能奠定了基础。基于酵母双杂交筛选的实验结果，进一步证实了候选靶蛋白真核延伸因子亚基与细胞凋亡进程相

5、关，利用免疫共沉淀和激光共聚焦两种实验方法证实，蛋白与蛋白在宿主细胞中相互作用，并且通过实验分析确定二者相互作用的区域位于蛋白末端位氨基酸残基区域内。进一步利用技术沉默细胞中内源性表达，并以此为基础研究与相互作用对和诱导细胞凋亡的影响。实验数据表明，表达沉默后，过表达蛋白所诱导的细胞凋亡被显著抑制，而所诱导的细胞凋亡被部分抑制。深入研究发现，沉默表达能够抑制蛋白和病毒诱导的和活化以及细胞色素释放，实验结果证实在和诱导细胞凋亡中起关键作用。此外，对病毒滴度进行测定发现，沉默表达抑制细胞凋亡有利于在细胞内复制。本研究揭示了蛋白引起宿主细胞凋亡机理，证明蛋白与宿

6、主细胞蛋白相互作用诱导细胞凋亡，为进一步揭示感染致病机理、研制新型疫苗以及疫病防控提供参考。关键词：禽呼肠孤病毒，蛋白，蛋白，凋亡，病毒增殖AbstractAvianreovirus(ARV)causesviralarthritis,chronicrespiratorydiseases，，，目录录图表录缩略词表第一章文章综述禽呼肠孤病毒感染简介禽呼肠孤病毒与细胞凋亡真核延伸因子简介研究目的与意义研究内容与技术路线第二章禽呼肠孤病毒蛋白诱导细胞凋亡引言：实验材料实验方法实验结果讨论小结第三章利用酵母双杂交技术筛选与相互作用的宿主细胞勒蛋白引言实验材料实验方法

7、实验结果讨论誠第四章蛋白单克隆抗体的制备引言实验材料实验方法实验结果讨小结第五章和相互作用的验证引言实验材料实验方法实验结果讨论第六章与相互作用对细胞凋亡的影响引言实验材料实验方法实验结果讨论捕第七章结论第八章仓丨衞点参考文献作者简介图表目录图禽呼肠孤病毒粒子结构示意图表各基因节段编码的蛋白及功能简介图诱导细胞凋亡通路简介引自文献【图的生物学功能简介，引自文献图基因的扩增图真核表达载体双酶切鉴定图在细胞中的融合表达图真核表达检测图融合蛋白引起的细胞凋亡检测及」次检测结果量化分析图转染表达后检测细胞活性图融合蛋白引起的、细胞凋亡检测图表达载体双酶切鉴定图在酵

8、母中的表达检测图酵母菌落鉴定表鸡脾脏文库筛选结果图半乳糖苷酶分析验