1型鸭甲肝病毒在鸭胚成纤维细胞中的增殖特性及病毒vp0蛋白免疫原性的初步研究

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2、性的祝步研究－一？？Ｉ．．■？’、．、－，ＶＶ、＇？＊，／＊、－齐晓燕＾，：．Ｊ＇、，’，？－：＇：，ＷＶ卡＾ｖ．．．．Ａ，＼．．‘一立－１指导教师汪铭书教授、＼ＶＶ．琴程安春教授’啦＇、、．Ｔ争＇学科专业预防兽医学＿卢研巧方向禽病学義令，＇－一兵护＇＇非Ｖ．产．．一＇，．，．－？一产、－？？一？？’Ｖ２０１５年６月、尸■、、‘－■，

3、－；＼；、－，、＞＊＂．．？＊、一Ｉ？？．巧？、，Ｖ＼＼一＇＇－‘■；＇－Ｘ％＇Ｊ，＼，空．＇榮；Ｖ‘＇■安．．－Ｖ．＇＇乂、声、、’；Ｖ１＇．＼论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它一教育机构的学位或证书所使用过的材料

4、。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研巧生签名；（月冷日关于论文使用授巧的寅明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即；学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。□。□，在密后适用本授权。本论文不保密本论文保密＿年解＂＂（请在Ｗ上□内划Ｖ）研究生签名；ＷＫ年《

5、月日／午导师签名：ｂ月【＾四川农业大学硕±学位论文中文摘要－１型鸭甲肝病毒（ｄｕｃｋｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＤＨＡＶ１）主要引起４周龄内－的维鸭发病＞。，死亡率髙达９０％｜＾１上，给养鸭业带来严重的损失为了建立０１１乂乂１的体外培养模型－，探巧病毒结构蛋白ＶＰＯ的免疫原性，本研巧对ＤＨＡＶ１在鸭胚成纤维细胞一系列的研究（ＤＥＦ）中的适应特性及病毒结构蛋白ＶＰＯ进行了，获得如下结果。－－１、用实验室分离保存的野韋株ＤＨＡＶＩＸ的尿裹液接种ＤＥＦ，盲传３代后ＤＥＦ

6、细胞出现轻微病变８－，第代后出现明显、稳定的细胞病变（ＣＰＥ）。采用ＲＴＰＣＲ、一－间接免疫巧光－、鸭胚接种试验等系列的方法证明ＤＨＡＶ１Ｘ能够在ＤＥＦ细胞内－良好增殖。英光定量ＲＴＰＣ民检测增殖规律，结果表明，病毒含量在接毒后口ｈ开一ｈ－％ｈ维持在定的水平始升高，４化达到高峰，病毒的含量基本趋于稳定。；４８－－－２、－ＸＶＰＯ将ＤＨＡＶ１结构蛋白全基因序列（ＶＰＯＦ）和部分序列（ＶＰＯＰ）－－ＥＴ－３２ａ＋）ＧＥＸ－４Ｔ分别克隆到表达载体ｐ（和Ｐ１中，构建原核表达质粒ｐＥＴ３２ａ－＋－－－（）／Ｖ

7、ＰＯＦ和ｐＧＥＸ４Ｔｌ／ＶＰ０Ｐ并转入大肠杆菌ＢＬ２１中，成功表达出ＶＰＯ全序列和部分序列蛋白。两种重组蛋白分别用亲和层析和切胶回收的方法获得纯度较高－的重组蛋白，且都能被兔抗ＤＨＡＶ１血清识别。－３、用纯化的ＶＰ０－Ｐ蛋白免疫健康的家兔，制备兔抗ＶＰ０Ｐ高免血清，琼脂扩散实验检测血清效价达到－Ｐ高免血清的中和效价１：１６；鸡胚中和试验检测兔抗ＹＰ０－达到－１：１４６ＶＰ０Ｐ高ＤＨＡＶ１。；间接免疫巧光试验表明兔抗免血清能识别－－４、将纯ＶＰ０Ｆ和ＶＰ０Ｐ－化的重组蛋白作为包被抗原，分别建立基于ＶＰ０Ｆ和

8、－ＶＰ０ＰＥＬＩＳＡ。－Ｆ蛋白的间接化蛋白的间接方法基于ＶＰ０ＩＳＡ方法的最佳条件为：‘－ｔＵ．６７雌／ｍｌ的ＶＰ０Ｆ重组蛋白３７口脖育Ｉｈ后４Ｃ包被过夜；５％明胶封闭０．５ｈ；’ＣＨＲＰ‘被检血清１：１６０稀释，３７赔育比ＩＧ：４００Ｃ；标记的