海蜇毒素磷脂酶a_2和穿孔蛋白基因的克隆与表达

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1、学校代码：10264研究生学号：M120111270上海海洋大学硕士学位论文题目：海蜇毒素磷脂酶A2和穿孔蛋白基因的克隆与表达MolecularCloning,RecombinantExpression英文题目：AnalysisofPhospholipaseA2andPoreFormingProteinGenesFromRhopilemaEsculentum专业：海洋科学研究方向：海洋生物分子生态姓名：杨洪指导教师：朱玲副研究员二O一五年六月三日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独

2、立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版

3、权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注王清印黄海水产研究所研究员主席李琪中国海洋大学教授委员李军中科院海洋所研究员委员李富花中科院海洋所研究员委员庄志猛黄海水产研究所研究员委员委员委员李昂黄海水产研究所助理研究员秘书黄海所1#楼12楼2015年6答辩地点答辩日期会议室月3日上海海洋大学硕士学位论文海蜇毒素磷脂酶A2和穿孔蛋白基因的克隆与表达摘要海蜇（Rhopilemaesculentum）隶属于刺胞动物门、钵水母纲、根口水母目、海蜇属，作为一种大型的可食

4、用经济水母，在我国海洋渔业中占有重要地位。其基础生物学研究深入，人工繁育、增养殖技术成熟，是研究水母发育过程基因表达调控及水母毒素组成、结构和功能的理想模式生物。本研究在454转录组测序的基础上，通过EST序列分析、cDNA末端快速扩增（RACE）技术从刺胞动物门的海蜇中克隆获得两个磷脂酶A2基因cDNA全长序列（命名为RePLA2-1、RePLA2-2）、两个穿孔蛋白基因cDNA全长序列（命名为RePFP-1、RePFP-2），并对这些基因进行了原核表达及重组蛋白功能分析。详细结果信息如下：1、RePLA2-1基因cDNA全长为824bp，开放阅读框（ORF

5、）504bp，能够编码167个氨基酸。预测RePLA2-1的分子式为C833H1283N235O241S15，推测的半衰期为30h，不稳定指数为61.93，属于不稳定蛋白。亲水性平均数（GRAVY)为-0.124，推测该蛋白为水溶性蛋白。根据氨基酸序列预测的分子量和等电点分别是18.93KDa和8.02。RePLA2-2基因cDNA序列全长840bp，预测的开放阅读框（ORF）包含495个核苷酸，编码165个氨基酸序列。N-端前23个核苷酸为信号肽，5’非编码区(UTR)和3’非编码区UTR分别包含6个核苷酸和336核苷酸。预测RePLA2-2的分子式为C84

6、4H1278N228O232S13，分子量和等电点分别是18.747KDa和8.94。推测的半衰期为30h，不稳定指数为32.64，属于稳定蛋白。亲水性平均数（GRAVY)为-0.276，推测该蛋白为水溶性蛋白。利用overlapPCR技术，获得了RePLA2-1、RePLA2-2基因组全长序列。RePLA2-1基因组序列全长2937bp，由4个外显子和3个内含子。RePLA2-2基因组序列全长2113bp，由2个外显子和1个内含子组成。Blast比对结果显示，RePLA2-1、RePLA2-2属于Phospholip_A2_3家族。系统进化分析表明，RePL

7、A2-1、RePLA2-2与僧袍芋螺、星状海葵、长牡蛎毒素PLA2聚为GIXPLA2一支，与GXIII、GXIIPLA2家族成员共聚为pfam-collection。I上海海洋大学硕士学位论文荧光定量PCR显示，蜇RePLA2-1、RePLA2-2基因在海蜇不同发育阶段均有表达。其中，RePLA2-1在海蜇水螅体发育阶段及横裂体发育阶段具有较高表达量。在横裂体发育阶段RePLA2-1mRNA达到四个发育阶段的最高值，为碟状体阶段的12.2倍；其次为水螅体体阶段，为水碟状体阶段的7.6倍；水母体阶段也达到了碟状体阶段的5.5倍。RePLA2-2在海蜇水母体、碟状

8、体发育阶段具有较高表达，分别为横裂体阶