两种蜘蛛毒素基因克隆和表达

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1、⋯．．懒Y21。醚石驾芗密级一～硕士学位论文两种蜘蛛的毒素基因克隆和表达GeneCloningandExpressionofToxinsfromTwoSpiders作者姓名：李滨学科专业：病原生物学学院(系、所)：基础医学院指导教师：舒衡平副指导教师：蒋立平论文答辩日期z!兰：苎!埠答辩委员会主席中南大学二。一二年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特y11]力n以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中

2、南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：互业年』月皿日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：丝!三年三月卫日硕士学位论文

3、中文摘要摘要研究背景当前，对蜘蛛毒素的生物功能及其作为药物先导分子在药理学研究中应用的探索，越来越受到天然药物开发研究者的重视。但是，天然毒液的产量较小这一问题，一直制约着其功能和活性的研究进展。为此，探索合成或者生产蜘蛛毒素的简便易行的方法，已经是当前该领域研究者亟待解决的问题。虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonushuwena)是分布在华南山区的一种体型较大的毒蜘蛛。目前已从其毒液中分离出多种蛋白质和多肽，并且已经鉴定部分蛋白质和多肽的生物活性。其中，多肽DkTx(double．knottoxin)可以通过刺激细胞

4、膜外侧孔区域激活辣椒素受体和瞬时受体电位香草酸亚型1(TI心V1)通道，促进降钙素相关肽的释放，进而起到舒血管及降血压的作用。森林漏斗蛛(Agelenasilvatica)是漏斗蛛科蜘蛛中，毒液毒性较小的蜘蛛，广泛分布在我国南北方的山林和草原地区，其可利用毒液麻痹昆虫进行捕食。目前，国内尚没有对该种蜘蛛的毒素研究，缺乏相关的数据，本研究将填补这些数据的空白。研究目的1、筛选DkTx的类似物，并进行功能分析。2、构建森林漏斗蛛毒腺的cDNA文库，筛选新的毒素基因。本研究得到国家自然科学基金项目(No．30901874)；

5、中南大学中央高校基本科研业务费专项(No．2010QZZD028)；中南大学研究生学位论文创新基金资助(No．2010ssxt260)；中南大学贵重仪器设备开放共享基金项目(No．2010-018，CSUZC2012004)资助。硕士学位论文中文摘要研究方法1、设计引物，在虎纹捕鸟蛛毒腺cDNA文库中，通过PCR扩增出目的基因。将目的基因构建至表达载体pVTl02U／a，利用酿酒酵母S．78株进行表达，并将表达产物分离纯化、鉴定。2、取森林漏斗蛛毒腺，利用CreatorTMSMARTTMeDNALibraryConst

6、ructionKit构建cDNA文库，设计引物，通过PCR扩增筛选新的毒素基因。研究结果1、在虎纹捕鸟蛛毒腺的cDNA文库中，成功筛选出4种DkTx类似物：FR+T3F34+P．5、FR+T3F34+P．6、FR+T5R32+P．8、FR+T5R32+P．105。并通过酿酒酵母S．78株表达了DkTx类似物，其中FR+T5R32+P．8的氨基酸序列得以正确表达。2、通过构建cDNA文库，筛选出5种cDNA序列：D7、D82、D134、D523、D787。其中D7、D134、D523、D787为新的蜘蛛毒素基因：D82与

7、Agelenopsisaperta的蜘蛛毒素Toxin_7超家族的序列完全相同。、结论1、成功筛选了4种DkTx的类似物，并通过酿酒酵母表达。2、通过构建森林漏斗蛛cDNA文库，成功克隆出4种新的毒素基因。关键词蜘蛛，毒素，cDNA文库，多肽，表达II硕士学位论文英文摘要BackgroundABSTRACTNowadays，sciencetistsonnaturaldrugarepayingmoreandmoreattentiontospidertoxinsandtheirphysicalfunctions，which

8、arebelievedtobepotentialdrugmolecules．However,theyieldofnaturalvenomslimitsthestudyofthetoxins’function．Avarietyofproteinsandpeptidescertificatedtobewithbiologicalact