华支睾吸虫溶血磷脂酶基因克隆表达和生物学功能研究

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1、华支牵吸虫溶血礴脂酶基因的克降表达和生物学功能研究中山大学博士学位论文华支睾吸虫溶血磷脂酶基因克隆表达和生物学功能研究专业：病原生物学博士生；马长玲导师：余新炳教授中文摘要华支睾吸虫病(clonorchiasis)，亦称肝吸虫病，是由华支睾吸虫(Clonorchissinensis，C．sinensis)感染引起的一种食源性人兽共患寄生虫病。主要流行于东亚和东南亚国家和地区，在我国分布于除西北4个省区外的其他省、自治区，以广东省感染最为严重，近年来呈上升趋势。华支睾吸虫成虫寄生于人和其他保虫宿主的肝胆管内，虫体分泌／代谢产物的化学性刺激及虫体本身的机械性刺激，

2、可引起胆管局限性扩张、胆管上皮细胞增生、管壁增厚、管腔狭窄等病理改变，临床上可诱发胆管炎、胆囊炎、胆管肝炎、肝纤维化甚至肝胆管肿瘤。在感染华支睾吸虫的动物模型中，华支睾吸虫合并二乙基亚硝胺能刺激卵圆细胞、胆管上皮细胞和肝细胞增殖，进而继发胆管癌。目前，有关华支睾吸虫致病机制的了解多源于流行病学调查和临床观察，对其致病机制的研究很有限。因此，对华支睾吸虫的分子致病机制研究，特别是阐明华支睾吸虫感染引起的肝胆管炎症、腺瘤样增生和癌变的分子机制对防治华支睾吸虫病意义非常重大。华支睾吸虫病的诊断主要是以病原学检查和血清学检查为主，诊断抗原主要是租抗原、代谢抗原等，鉴于

3、这些天然抗原来源困难，应用基因工程技术合成重组抗原，不仅是其解决途径之一，同时可望迸一步提高诊断的敏感性和特异性。寄生虫寄生于宿主体内产生的分泌／排泄抗原(excretory-secretoryantigen，ESA)直接涉及与宿主的相互作用，在致病方面起着重要作用，常为疫苗的候选抗原分子。同时，ESA也常作为诊断抗原，在血清学检查中其诊断的特异性和本谡题由：1．肝吸虫功能基因组与蛋白组学的研究广东省重大科技专项(2004A30801004)基金资助2．广州管圆线虫病和华支睾吸虫病关键防治技术的研究2006“863”专题(2006AA02ZA22)基金资助华支

4、擎吸虫溶血磷腊酶基闪的克隆表达和生物学功能研究中山大学博七学位论文敏感性均较高。有关华支睾吸虫的ESAs韩国学者研究较多，其在诊断方面的价值高于成虫的粗抗原。但有关华支睾吸虫ESAs具体的蛋白分子的研究甚少。磷脂酶是细菌、寄生虫等病原生物的分泌，排泄抗原之一，是直接作用于宿主的重要毒性因子。其作用的底物磷脂不仅是生物膜的组成成分，其功能还涉及生物体的信号传导、生长调节等过程。溶血磷脂(Lysophospholipid，LyPL)是磷脂酶A(PhospholipaseA，PLA)催化磷脂l位或2位酰基水解的产物，较高浓度的溶血磷脂可破坏生物膜的构象，甚至引起细胞

5、死亡。溶血磷脂的降解主要通过溶血磷脂酶l(1ysophospholipaseI，LysoPLAI)或II(1ysophospholipaselI，LysoPLAII)水解溶血磷脂的酰基产生甘油磷脂衍生物和游离的脂肪酸的方式。现有研究发现多种酶除了具有溶血磷脂酶水解溶血磷脂酰基的活性，还兼有其他的酶学活性。但分子量均约为25kDa的小分子溶血磷脂酶(即LysoPLAI和LysoPLA1I)催化水解溶血磷脂的酰基反应较特异，这两种酶理化性质亦很相似，广泛分布于哺乳类动物的组织和细胞。在控制体内溶血磷脂的水平以保持正常的生物学功能方面起着重要作用。LysoPLAI和

6、II含有与丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶活性区域相同的保守序列GXSXG。另外，用点突变的方法证实119scr、174胁和208Hb亦是该酶活性位点，Ser-Asp-His三个氨基酸组成了催化三联体，磷脂酶类通常具有这个保守结构。文献报道家兔的28kDa的LysoPLA同时还具有PLA2活性。目前，寄生虫的整个脂类代谢的研究非常少，对于LsyoPLA，只是在曼氏血吸虫和日本血吸虫基因组中发现了该基因，但功能尚未清楚。研究目的和意义基于华支睾吸虫的分泌／排泄抗原，特别是磷脂酶类可能在华支睾吸虫的致病和诊断方面起一定作用，从本课题组已构建的华支睾吸虫成虫eDNA质粒文

7、库中，寻找华支睾吸虫的磷脂酶，识别出溶血磷脂酶基因(暂命名为CsLysoPLA)全长eDNA编码序列，对其结构进行理论分析和功能预测；克隆和原核表达CsLysoPLA的cDNA编码区，测定CaLysoPLA重组蛋白酶活性，并鉴定CsLysoPLA是否为华支睾吸虫成虫的ESA，分析其免疫反应性，观察在体外它对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的作用，以初步探讨CsLysoPLA在华支睾吸虫致病过程中所起的作用。-U-华支挈吸虫溶ⅡIL磷腊酶基因的克隆表达和生物学功能研究中山大学博}学位论文研究方法lCsLysoPLA基因的生物信息学分析及其克隆、表达、纯化华支睾吸虫成虫c

8、DNA质粒文库进行表达序列标签(exp