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《华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析中国寄生虫病防治杂志ChinJParasitDisCon2004年4月第17卷第2期April2004,Vo1.17,No.2?论着?华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别,克隆和序列分析*何东苟,余新炳一,吴忠道,徐劲,吴德,胡旭初,陈守义(中山大学中山医学院病原生物学部,广东广州510089)【摘要】目的筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶(csLysoPIAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX一4T一1和真核表达质粒pcDNA3上,为进一步研究其功能奠定基础.方法
2、对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用Motif—san,NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析.根据PGEX一4T一1和pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAHcDNA编码序列设计引物,进行PCR扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX一4T～1和真核表达载体pcDNA3上.构建的PGEX-4T一卜csLysoPLAH,pcDNA3一csLysoPLAH重组表达质粒经PCR,双酶切及测序证实.结果发现csL
3、ysoPLAH基因,完整阅读框含708个碱基,编码235个氨基酸,理论分子质量为25.2628ku,理论pI为6.03.序列分析表明,csIysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,csLysoPIAH具有磷脂酶/羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域,并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽(即GXSXG).所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR,双酶切及测序证实与目标基因相符.结论发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因,并成功构建原核和真核重组表达质粒.【关键词】华支睾吸虫;溶血磷脂酶;克隆;序列分析【中图分类号】R383.22【文献标识码】A【
4、文章编号】1001-6627l2004)02—0096—04华支睾吸虫病是一种严重危害人体健康的人兽共患病.华支睾吸虫感染可引起胆管炎和胆管肝炎,晚期可发生肝硬化,并与原发性肝胆管癌患病率增加有关[1].通过识别华支睾吸虫新基因并对其进行功能研究,有助于阐明华支睾吸虫感染诱发肝胆管炎症及肝胆管癌的分子机制,并可能发现新的有价值的诊断分子和药物靶标.作者在对本室建立的华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库的随机测序筛选时,发现了华支睾吸虫溶血磷脂酶(Clonorchiasissinensislysophospho—lipasehomologue,cs
5、LysoPLAH)基因.为进一步研究其功能,作者对该基因进行了克隆和序列分析.材料和方法1材料.华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库由本室构建.克隆载体为pBluescriptIISK的改造载体(上海联众科技研究院),含SfiIA和SfiIB接头序列,酶切后可定向插入cDNA片断(SfiIA—SfiIB).原核表达质粒PGEX-4T-1,真核表达质粒pcDNA3由本室保存.DH5a及JM109大肠埃希菌由本室常规保存.BamHI,XhoI,dNTP和Tag酶购自TaKaRa公司.2方法2.1cDNA文库的筛选及EST的获取华支睾吸虫cDNA文库经转化
6、DH5a感受态细胞,蓝白斑筛选阳性克隆,阳性克隆经37℃14h～16h培养后用Qia—gen公司质粒抽提试剂盒提取质粒,过柱脱盐,琼脂糖凝胶电泳检测定量后作为测序模板.按DYETER—MINAT0R原理及DYEnamicMETterminatorkit(MegaBACETM)提供的标准操作方法进行96孔板式测序PCR反应,反应产物经酒精沉淀,洗涤等步骤后溶解于上样缓冲液,经热变性后上MegaBase1O00测序仪测序(上海联众科技研究院).将所得到的原始序列进行分析编辑,先在5端找Sf.1A酶切位点接头序列(GGCCATTATGGCC),去除5
7、端的接头及其之前的序列;然后在3端寻找SfiIB酶切位点接头序列(GGCCGCCTCGGCCA),若有此位点说明该插入基因已测全,除去该位点序列及其之后的序列,若没有该酶切位点,说明该基因未测全则保留全序列.2.2csLysoPLAH基因的识别与功能预测j将筛选得到的EST5端测序结果用Washington大学的WU—blast程序(版本2.0a19MP)进行同源性分析,对于同源性分析结果,依据200bp,95的标准进行UNIGENE归并;对3端测序结果,也依据以上标准进行归并.使用phred(版本0.990722.c)和phrap(版本0.9
8、90329)程序对有3端测序结果的克隆进行序列拼接.拼接后的序列利用NCBI站点的BIASTN,BLASTX分别在核苷酸及蛋白质水平上进行在线比较分析
