人溶血磷脂酸受体3基因的克隆、表达载体构建及其功能研究

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1、分类号——UDC学校代码!Q12鱼密级编号学号311Q8Q鱼2论文题目研究生：丕基目指导教师：陋揎坦直勒麴拯专业：生物丝堂皇佥王生物堂研究方向：生丝墨细胞值曼楚昱所在学院：生金型堂堂陵2014年4月22日内蒙古大学硕士学位论文IIllIIIIJIllUIIIIlUlllllUlIIIIJIllllJ原创性声明Y2571751本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得内苤直太堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本

2、研究所做的任何贡献均已．在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：盎赴日期：趁!生61；指导教师签名：日亨彩在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名

3、为内蒙古大学方可投稿或公开发表。学位论文作者签名：盎麴指导教师签名：日期：迎』蟾《13日期：豳‰巡缝龟；内蒙古大学硕士学位论文人溶血磷脂酸受体3基因的克隆、表达载体构建及其功能研究摘要目的：克隆人质子感知受体LPAR3基因、构建LPAR3基因的表达载体并瞬时转染HO．8910细胞，检测LP』啦的表达及研究其对细胞迁移的作用。方法：设计一对针对LPA3基因的引物，从含有人LPAR3序列的质粒中克隆不含终止密码子的LPAR3基因并亚克隆至lJpMDl9．T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体plRES2．EGFP用XhoI酶和BamHI酶双酶切回收后连接获得阳性重组

4、质粒plRES2．EGFP．LPA3，并测序鉴定；重组载体以LipofectamineLTX&PluxReagent介导转染人肾上皮细胞(293T细胞)。用RealtimePCR法检测外源基因在293T细胞中的表达。随后将其转染至卵巢癌细胞HO．8910中，用RealtimePCR：法检测LP—～R3在野生型细胞与转基因细胞中LPAR3基因表达量，同时检测在LPA刺激下的两种细胞的增殖情况。结果：测序和酶切证实了克隆到LPAR3基因并获得]7pIRES2．EGFP—LPAR3表达载体；荧光显微镜照相与RealtimePCR都证实了LP劁陷基因在293T细胞当中

5、的高表达；同时定量检测还发现LPAR3基因在人卵巢癌细胞(HO．8910细胞)中高表达。LPA梯度刺激HO．8910细胞后发现，LPA可以抑制细胞的增殖效应，同时LPA刺激LPAR3转基因细胞相比未转染细胞增殖能力下降。结论：基因克隆构建得到LPAIu基因和表达载体plRES2．EGFP．LPAR3，转染细胞检测到LPAR3在细胞内高表达，同时还发现LPA刺激可以抑$iJHO．8910细胞的增殖，且转染LPAR3基因后LPA抑制细胞增殖的作用增强。内蒙古大学硕士学位论文关键词：LPA3受体；HO．8910细胞；细胞增殖II内蒙古大学硕士学位论文CLONIGAN

6、DCONSTRUCTIONOFEXPRESSIONVECToROFHUM已▲NlYSoPHoSPHATIDICACIDRECEPTORLPAR3ANDITSFUNCTIONRESEARCHABSTRACTAims：CloningHumanProtonSenseReceptor(LysopholipidsAcidReceptor3)、constructLPAR3geneexpressionvectorandtransienttransfectionHO-8910cells，detecttheexpressionofLPAR3andtheroleincellmig

7、ration．Method：DesignapairofprimerofLPAR3thencloingLPAR3geneintovectorPMD19一T；Bysequencing，digestionandligation，LPAR3wasdirectionallyclonedintoeukaryoticexpressionplasmidplRES2-EGFRThereconstructedplasmidwasidentifiedwithenzymedigestionandsequencing；theplasmidwastransfectedintoHO一891

8、0cellswithlipofecta