人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建

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1、人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建李昕,王平,李刚,刘屹立【关键词】受体;,肾上腺素能β3;,载体　　β3ARgenecloningfromhumanbladderdetrusorsmoothmuscleandconstructionofitsantisenseeukaryoticexpressionvector　　【Abstract】AIM:Toclonehumanbeta3adrenoceptor(β3AR)genefromhumanbladderdetrusorsmoot

2、hmuscleandconstructitsantisenseeukaryoticexpressionvector.METHODS:Theβ3ARfulllengthcDNAplifiedfromhumandetrusormusclecellsthroughRTPCR(BamHIandClaIsitesprimer,andHindIIIintodo)andsubclonedintoclonevector(pUC18).ThetargetgeneClaI/HindIIIsitesofpUC18easd

3、esignedbyrestrictionendonucleaseanalysisandsequencing.CONCLUSION:β3ARfulllengthcDNAhumanbladdersmoothmuscleandtheirantisenseeukaryoticexpressionvectorsHI及ClaI酶切位点，下游引物加有HindIII酶切位点，将该片段插入pUC18载体中，摇菌扩增后，用ClaI和HindIII切下目的基因，然后将目的片段反向插入逆转录病毒表达载体pLNCX上.最后对

4、产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定.结果：经琼脂糖凝胶鉴定，所克隆的目的基因大约为1.2kb，并成功地连接到逆转录病毒载体pLNCX上，经测序证明，插入的目的片段其碱基序列与Genbank上报道的完全一致，且插入载体的方向完全正确.结论：成功克隆了人逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的全长cDNA序列和构建了其反义真核表达载体.　　【关键词】受体;肾上腺素能β3;载体　　0引言　　膀胱逼尿肌活动亢进是下尿路症状的常见原因.研究发现，肾上腺素能β受体（βadrenoceptor,βAR）亚型能够介导

5、膀胱平滑肌松弛，对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用〔1〕.但何种βAR亚型介导逼尿肌松弛，国内外学者还有一定的争论〔2-3〕.为进一步探讨βAR亚型在逼尿肌中功能奠定基础，我们拟采用反义基因（antisense）技术，构建βAR亚型的反义真核表达载体，封闭三种βAR中的任意两个，得到表达单一亚型的细胞克隆，再进一步进行研究，以确定βAR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据.　　1材料和方法　　1.1材料人膀胱逼尿肌标本取自手术中因

6、膀胱癌而行膀胱全切患者标本，取正常组织的膀胱平滑肌约1g，迅速放入液氮中10min，再放入-70℃冰箱中保存.pUC19购于Takara公司；逆转录病毒载体plncx购自Invitrogen公司；JM109大肠杆菌感受态菌株购自Takara公司.限制性内切酶和DNA工具酶BamHI，HindIII，ClaI等内切酶购于华美生物有限公司；RNase和T4DNA连接酶购于Promega公司.Trizol试剂及RNALAPCRTMKit(AMV)购自大连宝生物公司；QiAquickGelExtractio

7、nKit购于Qiagen公司；质粒提取试剂盒购自Gibco公司.　　1.2方法　　1.2.1人膀胱逼尿肌中β2AR全长基因的克隆称取冰冻状态下的膀胱逼尿肌组织约200mg，采用宝生物公司的Trizol试剂并按使用说明书操作提取总RNA，10g/L低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性.根据Genebank提供的β3AR基因序列（NM_000024）采用Oligo6.6软件设计如下两对引物，外引物及内引物，应用套式PCR来扩增目的基因.　　内引物：上游引物F01：5＇CCGGATCCATCGATAT

8、GGGGCAACCCGGGAACGG3＇,下游引物R01：5＇AGGAAGCTTTTACAGCAGTGAGTCATTTG3＇;外引物：上游引物F02：5＇TGCGCTTACCTGCCAGACTG3＇,下游引物R02：5＇GCCCTTCCTTCTGCATATCTC3＇.　　　　其中内引物是针对蛋白质编码区（CDS:220~1461bp）设计的，其上游加有BamHI及ClaI酶切位点，下游加有HindIII位点，使其能反向连接在pLNCX的多克隆位点上.外引物F02，R0