人逼尿肌细胞β肾上腺素能受体单一基因亚型细胞克隆的构建

《人逼尿肌细胞β肾上腺素能受体单一基因亚型细胞克隆的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、0-998￡8B分类号墅!箜：i单位代码：10159学号：200316124中回錾升夫拳博士学位论文题目：人逼尿肌细胞B一肾上腺素能受体单一基因亚型细胞克隆的构建Constructionofsinglegenecloneofp—ARfromhumandetrusorcell，研究生：奎噬导师：至±学科专业：盐壁生论文课题起止时间：呈Q坚主兰旦二兰Q!曼生!旦论文完成时间：兰鲤鱼生i旦中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中

2、不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。乓、r论文作者签名：兰茇』S日期：兰：生[≥q中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，印：研究生在攻读学位期问论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学

3、。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：培养皿http://www.huayu-glass.com/人逼尿肌细胞p一肾上腺素能受体单一基因亚型细胞克隆的构建膀胱逼尿肌活动亢进是下尿路症状的常见原因，临床上表现为尿频、尿急和急迫性尿失禁，是膀胱储尿功能障碍的表现。最近研究发现，p肾上腺素能受体(p—adrenoceptor，p—AR)亚型能够介导膀胱平滑肌松弛，对维持储尿过程中膀胱良好的顺

4、应性起着关键作用。但究竟哪一种B—AR亚型介导逼尿肌松弛，国内外学者还有一定的争论。为进一步探讨B—AR亚型在逼尿肌中功能奠定基础，我们拟采用反义基因(antisense)技术，构建B—AR亚型的iRNA干涉分子，封闭三种B—AR中的任意两个，得到表达单一亚型的细胞克隆，再进一步进行研究，以确定B—AR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据。第一部分、膀胱平滑肌细胞的培养和鉴定鄹吾建立膀胱平滑肌细胞的培养方法、获得大量具有正常生物学特性的细胞是深入研究细胞生物学特性和构建组织工程膀胱的必

5、要条件。近年来，F—H．Ma等对人膀胱平滑肌细胞进行了体外培养，并对B肾上腺素能受体分布进行了初步的研究，但没有对平滑肌细胞中B肾上腺素能受体生物学特性进行描述。为了更进一步深入研究人膀胱平滑肌细胞中B肾上腺素能受体的生物学机制，本研究进行了体外人膀胱平滑肌细胞培养，并进行形态学及生物学特性观察。我们采用胶原酶消化法自标本分离出膀胱平滑肌细胞进行培养并予鉴定，现报告如下。培养皿http://www.huayu-glass.com/培养皿http://www.huayu-glass.com/实验方法1实验材料本研究应用正常膀胱平滑肌组织作为研究材

6、料，标本来源于住院膀胱平滑肌组织三块均为膀胱癌行膀胱全切术患者，其患者经术前经尿动力学检查证实没有逼尿肌功能障碍。2．主要试剂胶远酶II型、胎牛血清、DMEM均购自Gibco公司胰酶购自上海实生细胞技术有限公司3．实验方法(1)尿N-3z滑肌细胞原代培养标本取出后于10％青霉素溶液中浸泡5分钟，在用生理盐水及DMEM各漂洗一次，除去粘膜层及浆膜面结缔组织，肌肉剪成肉糜后转移至0．1％胶原酶(II型)溶液中，37cc振荡消化6小时，消化液混浊组织块呈絮状提示消化良好，反复吹打絮状组织块后静置5分钟，吸出混悬液，混悬液离心(1000转／IIIin，

7、离心半径13cm)5分钟，沉淀的细胞移入培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM置于50rnlZLCO：、37℃、饱和湿度孵育箱中静置培养，培养基每周更换2—3次，以上步骤均遵循无菌操作原则。(2)尿路平滑肌细胞的传代培养尿路平滑肌细胞达到90％融合后进行传代培养。弃去旧培养基，以Hanks液洗涤壁上的细胞两次，向培养皿中加入混合消化液，(0．25％胰酶：0．02％EDTA=1：1)覆盖细胞表面，37℃孵育约5分钟观察到细胞间隙增大，细胞成圆形，部分悬浮于消化液中时，向培养皿中加入0．8％胎牛血清终止消化，将细胞悬液离心(1000转／IIlin

8、、离心半径13cm)5分钟，沉淀的细胞以1：4的分配比例转移至新培养皿中继续培养，每三天换液一次，当细胞铺满瓶底时，又可依同法传代。(3)形态学观察及