新型姜黄素同源物c66对小鼠糖尿病肾病保护作用的机制研究

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1、前言糖尿病肾病(DN)是糖尿病慢性微血管并发症，是导致终末期肾脏病的重要原因。DN早期表现为肾小球体积增大，基底膜轻度增厚，系膜区轻度增宽，肾小球滤过率增加和微量蛋白尿。随着病情进展，逐渐发展为肾小球系膜区重度增宽、结节性肾小球硬化、足细胞数量严重减少、肾小管萎缩和肾间质纤维化等病理变化，出现大量蛋白尿、严重水肿、肾小球滤过率降低及尿毒症的临床表现。然而，目前DN尚缺乏有效防治手段。DN的发病机制较为复杂，其中氧化应激是DN的重要发病机制。氧化应激是指机体在受到有害刺激时，活性氧簇(ROS)产生

2、过多，超过了机体抗氧化防御系统清除能力，导致氧化系统平衡紊乱、组织细胞损伤。在高糖状态下，氧化应激增强，可通过多种途径引起足细胞凋亡、肾小球滤过膜的物理屏障和电荷屏障损伤、肾脏血流动力学改变、细胞外基质聚积、蛋白尿等，诱导DN的发生、发展。因此，提高机体抗氧化能力是减缓DN病情进展的有效策略。核因子相关因子2(Nrf2)在机体抗氧化系统中起到核心作用。Nrf2可激活下游抗氧化基因的转录，延缓DN的病情进展。姜黄素是天然植物提取物，可上调Nrf2，然而天然姜黄素生物利用率低，极大地限制了它的临床应

3、用。新型姜黄素同源物C66弥补了天然姜黄素的这一缺点，其生物利用率大幅度提高，具有良好的临床应用前景。然而，C66对DN的保护作用机制尚不明确。我们之前的研究发现，C66可显著上调糖尿病主动脉中的Nrf2表达，减轻糖尿病主动脉病理改变。为了探讨C66是否通过上调肾脏Nrf2减轻DN，我们在C57BL/6J野生型及C57BL/6JNrf2敲除小鼠中采用多次小剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法诱导糖尿病模型。模型建立成功的同时给予糖尿病及同龄对照小鼠C66干预6个月（5mg/kg，隔日一次）。实验结果显示

4、，在野生型小鼠中，C66显著减轻了糖尿病引起的蛋白尿及肾脏纤维化；而Nrf2基因敲除部分地减弱了C66对DN的保护作用。这些结果一方面证实了C66通过上调Nrf2对DN起重要保护作用；另一方面提示除上调Nrf2外，仍有其他作用机制参与C66对DN的保护作用。I在胞浆中，肌动蛋白结合蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)结合Nrf2，防止Nrf2进入细胞核发挥作用，并介导Nrf2的蛋白酶体降解。因此，下调胞浆中Keap1水平是上调Nrf2的有效方法。研究表明，微小RNA-200a(mi

5、R-200a)可结合并降解Keap1的mRNA，进而导致Keap1蛋白水平下调，而姜黄素被证实可上调miR-200a水平。因此，上调miR-200a可能是C66上调Nrf2的机制。为了探讨该机制是否存在，我们在C66处理的野生型糖尿病小鼠中应用miR-200a的特异性抑制剂-锁核苷酸修饰的抗miR-200a(LNA-200a)。结果显示C66可显著上调肾脏miR-200a、降低Keap1mRNA及蛋白水平、上调Nrf2蛋白水平及其下游抗氧化基因血红素加氧酶1(HO1)、醌氧化还原酶-1(NQO1

6、)的mRNA水平；而LNA-200a的应用完全阻断了C66的这些作用。这些结果证实C66通过上调miR-200a进而上调Nrf2。miR-21在DN的发生、发展中起关键作用。研究证明姜黄素可下调miR-21。我们首先在野生型小鼠肾脏中确认了C66对miR-21的下调作用。为进一步排除Nrf2的影响，我们在Nrf2敲除糖尿病小鼠中分别给予C66和miR-21的特异性抑制剂LNA-21（阳性对照）干预6个月，结果显示C66和LNA-21相似程度地降低了肾脏miR-21的表达，减轻了糖尿病引起的蛋白尿

7、及肾脏损伤。这些结果证实除上调Nrf2以外，C66尚可通过抑制miR-21减轻DN。本研究阐明了C66减轻DN的作用机制，为该药物的临床应用提供了实验依据和理论基础。II中文摘要新型姜黄素同源物C66减轻小鼠糖尿病肾病的机制研究随着糖尿病发病率的增加，糖尿病肾病(DN)的发病率也呈逐年上升趋势。DN是引起终末期肾脏病的重要原因，导致极高的致死率和致残率，然而目前尚缺乏有效防治手段。因此，寻找有效防治DN的新方法至关重要。氧化应激是DN的重要发病机制。高血糖状态下，肾脏活性氧簇(ROS)产生增多，

8、超过了机体抗氧化防御系统的清除能力，通过多种途径诱导DN的发生、发展。核因子相关因子2(Nrf2)在机体抗氧化系统中起到核心作用。作为转录因子，Nrf2可进入细胞核，结合下游抗氧化基因启动子区的抗氧化反应元件(ARE)，启动这些基因的转录，从而减轻糖尿病引起的氧化应激损伤，延缓DN的病情进展。姜黄素是天然植物提取物，对多种疾病模型具有良好的保护作用，然而其生物利用率低，极大地限制了它的临床应用。在DN动物模型中姜黄素的有效剂量为50-200mg/kg，每日一次；而新型姜黄素同源物C66的有效剂量